牙鲆孵化酶的分离纯化及其部分生物化学性质研究

利用凝胶过滤柱层析和阴离子交换柱层析技术,从牙鲆（Paralichthys olivaceus）胚胎孵化液中分离纯化出了大小约为34．8ku的牙鲆孵化酶。该酶卵膜裂解的最适反应温度为35℃,最适pH为7．0;对底物酪蛋白的米氏常数Km值为1．53mmol／L。该酶对丝氨酸蛋白酶和胰蛋白酶的特异性抑制剂非常敏感,而对其他蛋白酶抑制剂不敏感,表明该酶极可能是一种丝氨酸蛋白酶类型的胰蛋白酶。此外,该酶可浓度依赖性地被EDTA所抑制,被Cu^2＋所强烈抑制,被Ca^2＋和Mg^2＋所激活,对Zn^2＋则不敏感,表明该酶很可能是一种金属蛋白酶。     

氮磷营养盐对中肋骨条藻生长及硝酸还原酶活性的影响

通过实验室培养,在不同氮磷浓度及氮磷比率的营养条件下,对中肋骨条藻（Skeletonema costatum）的生长及藻细胞硝酸还原酶的活性进行研究。实验结果表明,中肋骨条藻属于营养型藻类,氮磷营养盐的添加,极大地促进了藻细胞的增殖。在接种后的第4～5天,各培养组藻密度达到最大值并与对照组形成极显著性差异（P〈0．01）。实验进一步发现,环境中的氮、磷浓度及氮磷比率都会影响中肋骨条藻的生长及藻细胞硝酸还原酶活性（NRA）。此外,在各培养组中,中肋骨条藻硝酸还原酶活性的最大值（NRAmax）均出现在指数生长期（接藻后第1,2天）,早于最大藻密度的出现时间（第4,5天）,这表明藻对营养盐的同化速率与生长速率并不一致,后者存在一定的滞后效应。在本实验条件下,中肋骨条藻的硝酸还原酶活性存在一定的阈值。     

瘤状软骨凹顶藻化学成分研究

采用硅胶柱色谱以及Sephadex LH-20凝胶色谱手段,对海洋红藻瘤状软骨凹顶藻(Chondrophycus papillous Garbary et Harper)进行化学成分研究,分离得到5个化合物.通过MS、NMR等方法对得到的化合物进行结构确证,分别鉴定为邻苯二甲酸二丁酯(Ⅰ),邻苯二甲酸二异辛酯(Ⅱ),胆甾醇(Ⅲ),植醇(Ⅳ)和4-羟基苯甲醛(Ⅴ).所有化合物均为首次从该种海藻中分离得到.通过MTT法对得到的单体化合物进行细胞毒活性筛选,结果显示所有化合物在10 mg/L浓度下均无明显活性.     

壳聚糖硫酸酯金属配合物的抗氧化活性

以吩嗪硫酸甲酯-NADH为超氧阴离子自由基(O_2~(·-))产生、检测体系和EDTANa_2-Fe(Ⅱ)-H_2O_2为羟自由基(~·OH)产生、检测体系,对壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物和不同分子质量壳聚糖进行了抗O_2~(·-)和~·OH自由基的活性研究.结果表明,壳聚糖硫酸酯金属配合物对于O_2~(·-)自由基的清除能力明显高于壳聚糖,在质量浓度为0.025 g/L时,壳聚糖硫酸酯铜配合物对O_2~(·-)自由基的清除能力达到94.18%,壳聚糖硫酸酯锌配合物达到93.19%;壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物对~·OH自由基的清除能力(67.39%、60.46%)低于相同分子质量的壳聚糖(88.06%),而高于高分子质量壳聚糖761 ku(18.71%);壳聚糖分子质量大小对O_2~(·-)和~·OH自由基的清除能力有较大影响,质量浓度为1.6 g/L壳聚糖分子质量为20 ku时,对O_2~(·-)清除率达54.69%,而分子质量在761 ku时,对O_2~(·-)清除率仅为35.50%;各样品对O_2~(·-)和~·OH自由基的清除能力均随着质量浓度的增加而上升,壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物在相当低的浓度下(0.025 g/L)就可以达到明显清除O_2~(·-)自由基的效果(≥90%).     

Antiangiogenic activity of low-temperature lysozyme from a marine bacterium <Emphasis Type="Italic">in vivo</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">in vitro</Emphasis>

We extracted marine low-temperature lysozyme (MLTL), a novel lysozyme, from a marine microorganism through fermentation. Our previous study suggested that a low molecular weight (16 kDa) may exert anti-tumor activity through antiangiogenesis. In this study, we extracted a high weight (39 kDa) and investigated its antiangiogenic activity in vivo and in vitro. Using zebrafish embryos as an in vivo study model, we found that treatment with MLTL significantly inhibited the growth of subintestinal vessels (SIVs) in a dose-dependent manner and that 400 μg/ml MLTL was sufficient to block the growth of SIVs. An in vitro study conducted using human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) revealed that MLTL suppressed the proliferation, migration and tube formation of HUVECs in a dose-dependent manner. Interestingly, assays by flow cytometry and DNA electrophoresis indicated that MLTL was able to induce apoptosis of HUVECs. Moreover, further study demonstrated that the disruption of intracellular Ca²⁺ homeostasis may play an important role in MLTL induced apoptosis of HUVECs. Taken together, the results of this study demonstrate for the first time that MLTL inhibits angiogenesis through its pleiotropic effects on vascular endothelial cells and induces apoptosis through regulation of cellular Ca²⁺ levels. The results of this study also revealed a possible mechanism underlying the antiangiogenic effect of MLTL and suggested that MLTL may be a promising new antiangiogenic agent for use in cancer therapy.     

耐盐真菌Aspergillus variecolor B-17产生的烃基苯甲醛衍生物及其细胞毒活性

为从极端环境微生物中获得抗肿瘤药物先导化合物,作者从采自内蒙古盐湖的沉积物中分离了96株耐盐真菌.采用小鼠乳腺癌细胞株tsFT210和海虾(Artemia salina Leach)筛选抗肿瘤活性微生物,1株耐盐真菌Aspergillus variecolor B-17表现出明显的细胞毒活性和海虾致死活性.采用活性跟踪的分离方法,从该菌株的大量发酵产物的石油醚层提取物中分离得到了3个单体化合物.通过一维、二维超导核磁共振、质谱等波谱方法确定其结构分别为:2-(E-1-庚烯基)-3,6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(1)、2-庚基-3,6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(2)、2-(E,E-3,5-庚二烯基)-3,6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(3).化合物1、2和3对P388、A549、HL-60和BEL-7402肿瘤细胞表现弱的细胞增殖抑制活性,IC50值分别为88,68,66,65 μmol/L,9,99,110,84 μmol/L以及77,147,93,203 μmol/L.     

一种水不溶灰树花菌丝体多糖(GF4A)硫酸酯化研究

以灰树花发酵菌丝体水不溶性多糖GF4A为原料,以三氧化硫三甲胺盐(SO3·Me3N)为酯化试剂,探讨了GF4A的硫酸酯化工艺.实验结果表明,当三氧化硫与GF4A中单糖摩尔比为5.8∶1、反应温度为80 ℃、反应时间6 h时,所得酯化产物(SGF4A)水溶性好、产率高.该产物硫酸酯取代度为1.6, 相对分子质量为88 kD.通过红外光谱及核磁共振碳谱分析表明,糖残基中所有C-6羟基以及部分C-4和C-2位羟基被酯化.体外实验表明,SGF4A具有较好的抗凝活性.     

扁额原细首纽虫蛋白酶活性的初步研究

以酶学分析方法研究了不同温度、pH及摄食后不同时间扁额原细首纽虫蛋白酶活性的变化.结果表明,扁额原细首纽虫蛋白酶活力在pH为3和10时出现2个峰值,酸性条件下其蛋白酶的活性明显高于碱性条件.在20～80 ℃温度范围内,纽虫酸性和碱性蛋白酶活性表现出2种不同的变化趋势.酸性蛋白酶活力在50 ℃达到最大值;而碱性蛋白酶活力在40 ℃达到最大值,50 ℃酶活性急剧下降,对高温比较敏感.扁额原细首纽虫在摄食后,酶活力有明显变化,酸性蛋白酶在摄食后2 h达到最大值,之后下降,摄食后8 h达到最低水平,之后又有所回升.而碱性蛋白酶活性在摄食后8 h达到最大值,16 h后维持在较低水平.     

单环刺螠纤溶酶的分离纯化及其性质的初步研究

从单环刺中制得单一组分的纤溶活性纤溶酶,并对其性质进行初步研究.单环刺体组织液经离心,超滤,离子交换层析,凝胶过滤等方法进行分离纯化,制得单一洗脱峰酶组分,经Native-PAGE电泳分析,SDS-PAGE电泳分析和飞行质谱分析,鉴定了酶制品纯度和相对分子量,进行了体外溶血栓试验.所得纯品UFEIa水解酪蛋白的比活力为442.0 U/mg,纯化倍数为12.1倍,回收率为27.0%.UFEIa为单一组分,相对分子量约23 800 Da.体外溶血栓实验表明此纤溶活性蛋白酶与蚓激酶相比具有很好的溶血栓活性.     

霞水母刺丝囊毒素溶血活性的稳定性研究

从霞水母Cyanea sp.中分离刺丝囊,提取刺丝囊毒素(NV),并研究了温度、pH和几种化学组分对其溶血活性稳定性的影响.实验结果表明,在4～37℃范围内NV的溶血活性与温度变化密切相关,毒素在4℃以下几乎没有发生溶血反应,在37℃以下反应45 min以后,溶血活性达到最大值;毒素的溶血活性对pH敏感,在pH 7.8时.溶血活性最强,溶血率为93.53%.EDTA、NaCl和还原型谷胱甘肽(GSH)对NV溶血活性都具有稳定作用.通过正交实验发现,GSH对溶血活性的影响最大,当提取液中含有1.0 mmol/L GSH和5.0 mmol/L NaCl时毒素的溶血活性最强.DTT(二硫苏糖醇)明显降低毒素的溶血活性,说明毒素中溶血蛋白的活性很可能与分布在蛋白质表面的二硫键有关.Ca2+虽然能够增强毒素的溶血活性但是对毒素并没有稳定作用,所以Ca2+可能只是毒素溶血活性的活化剂.甘油对毒素的稳定作用不明显.