壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

鳗弧菌膜绑定溶胞壁质转糖酶MltD的表达纯化及生物信息学分析

本研究将新发现的鳗弧菌毒力相关基因mltD(膜绑定溶胞壁质转糖酶基因)克隆于表达载体pET-32a(+),在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达,并以镍琼脂糖亲和层析柱纯化表达的融合蛋白;经SDS-PAGE分析,纯化的融合蛋白为单一条带,分子量约为70.2 kDa,与理论预测值相符.生物信息学分析表明,鳗弧菌MltD由523个氨基酸组成,与其他弧菌的MltD氨基酸序列有较高的相似性;二级结构以a螺旋和无规则卷曲为主;功能区包括N端的信号肽区域、1个糖基转移酶结构域和C端的3个溶解酶结构域;蛋白的N端具有一段脂蛋白信号肽,信号肽外的其他部分为非细胞质蛋白.鳗弧菌MltD蛋白为亲水性;不稳定系数为27.40,属于稳定性蛋白;整个蛋白分子共有24个可能的抗原决定簇,具有较强的抗原性.推断MltD蛋白为1种外周膜脂蛋白,在弧菌中相对保守,抗原性强,可应用于抗弧菌病疫苗的开发研制.     

三疣梭子蟹HMGR基因的克隆及其在蜕皮中的表达分析

为了研究3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMGR)在甲壳动物蜕皮调控中的作用,采用RT-PCR和c DNA末端快速扩增技术(RACE),克隆得到三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)HMGR基因的c DNA序列(Gen Bank登录号:KF280756)。该序列全长2575bp,包括一个53bp的5′端非编码区,一个686bp的3′端非编码区和一个长度为1836bp的开放阅读框,编码611个氨基酸。该氨基酸序列与已公布的美洲海鳌虾HMGR氨基酸序列相比一致性达65%,具有Ⅰ型HMGR保守催化区域、两个HMG-Co A结合基序和两个NADP(H)结合基序。采用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)技术,分析三疣梭子蟹HMGR基因的组织差异表达及在蜕皮周期中的表达水平变化,结果表明HMGR基因在三疣梭子蟹大颚器(MO)中的表达量最高,在其它组织中表达量均极低;在三疣梭子蟹蜕皮周期中,大颚器中HMGR基因的表达量自A期至D0亚期升至最高,然后下降,至D4亚期最低。验证了大颚器是三疣梭子蟹合成甲基法尼酯的唯一器官,表明HMGR在三疣梭子蟹蜕皮调控中起着重要作用。     

富含古罗糖醛酸的褐藻多糖生产菌株的构建

为获得古罗糖醛酸(Guluronate)含量高的细菌胞外褐藻多糖,利用PCR从海洋细菌Pseudomonassp.QDA中克隆了其甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因(algG),连接入质粒pMF 54Km,构建了重组表达载体pMF54 Km-algG。利用三亲接合法将pMF54 Km-algG转入菌株QDA中,获得algG过量表达重组菌株QDA-G1。H-NMR测定结果表明,QDA-G所产的褐藻多糖中β-D-甘露糖醛酸(M)与它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)的比值为0.38,G的质量分数达到74.2%,比野生菌株QDA提高了26.4%。且重组菌株遗传稳定性良好,连续传代20代后,M/G的比值无明显变化。     

大黄鱼白细胞介素17受体E-like的分子特征及进化分析

白细胞介素17受体(Interleukin 17 receptor,IL-17R)家族与IL-17细胞因子家族介导的各类反应有着密切联系.IL-17RE-like(IL-17REL)是一类最新发现的IL-17受体,其结构与IL-17RE相似,但尚未发现其配体.本研究克隆得到大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-17REL(Lyc IL-17REL)的全长c DNA,其开放阅读框全长1 659个核苷酸,推断可编码一个由552个氨基酸组成的蛋白,含有信号肽、胞外段、跨膜区和胞内段.与其他物种的IL-17REL相似,Lyc IL-17REL蛋白的胞外段具有一个保守的FN I-like结构域,而胞内段缺少IL-17受体家族保守的SEFIR(SEF and IL-17R)结构域.多序列比对分析表明Lyc IL-17REL与日本河豚(Takifugu rubripes)IL-17REL的氨基酸序列同源性最高,序列一致性可达57.0%.系统进化分析表明,脊椎动物的IL-17受体家族可分为2类,IL-17RA/RB/RD为一类,IL-17RC/RE/REL为一类.其中鱼类及高等脊椎动物的IL-17REL与IL-17RE亲缘关系最近,并且推测二者可能是由同一基因从硬骨鱼类之前的物种中分化而来.组织分布表明Lyc IL-17REL在所有被检测的组织中为组成型表达,在黏膜相关组织如小肠和鳃中的表达量最高.大黄鱼受嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)诱导刺激后,Lyc IL-17REL在其头肾及鳃中的基因转录水平均显著上调.这表明Lyc IL-17REL可能在细菌感染引起的免疫反应中起着重要作用.     

基于案例推理的海洋涡旋特征信息空间相似性研究

目前对海洋涡旋的分析主要采用水团、近海海流分析和数值模拟方法,这些方法结合不同的区域资料已经有过很多成功的研究。但面对日益增长的多源、大面积海洋遥感数据,在快速自动化提取海洋涡旋的空间信息方面还存在很多难题。因此该文针对海洋涡旋空间信息的快速定量分析问题,提出了基于案例推理(Case-Based Reasoning,CBR)的海洋涡旋空间相似性研究方法。该方法首先采用多源数据(遥感数据、遥感反演数据、观测数据等)进行历史涡旋案例定量分析,并构建基于CBR的海洋涡旋案例表达模型和历史案例库;继而采用“基于重心矢径的序列分析方法”进行历史涡旋空间相似性分析,并结合典型的海洋涡旋区域给出具体实例。研究结果表明该方法是可行的。     

黄鳍棘鲷IGF-2基因克隆及IGF-1/2在胚胎发育过程中的表达特性分析

类胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factors,IGFs）是生物生长轴下游的关键调控因子,其对促进细胞分化与机体生长具有重要的作用。为深入研究IGF-1和IGF-2基因在黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）胚胎发育过程中表达机制及可能发挥的作用,本文利用分子克隆技术分离鉴定了黄鳍棘鲷IGF-2基因cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。同时,在对其胚胎发育过程连续观察的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,测定并分析了黄鳍棘鲷胚胎发育不同时期IGF-1和IGF-2基因m RNA的表达情况。实验结果表明,IGF-2基因cDNA序列全长为1 736 bp,其中开放阅读框648 bp,共编码215个氨基酸。多重序列比对分析发现,黄鳍棘鲷IGF-2氨基酸序列与同属鲷科鱼类的大西洋鲷（Sparus aurata）相似性为99.95%,与三长棘赤鲷（Pagrus auriga）相似性为98.14%,与其他硬骨鱼类的IGF-2也有较高的相似性,显示出IGF-2在硬骨鱼类进化关系上的保守性。在水温为（26.5±0.5）℃,p H为8.0和盐度为28的条件下,...     

六溴环十二烷胁迫下红树蚬鳃及肝胰腺线粒体基因表达定量研究

红树蚬(Polymesoda erosa)作为一种主要栖息于潮间带的沼泽地或红树林的双壳贝类,近年来很多研究都证明其具有做为海洋污染监测指示物种的潜力。红树蚬受六溴环十二烷(HBCD)不同浓度(0、0. 086、0. 860、8. 600μg/dm~3)及不同天数(1、3、11、15、22 d)胁迫后,从转录组上调文库中挑取6个线粒体编码基因:细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ、Ⅲ(COXⅠ、COX Ⅲ),NADH脱氢酶亚基Ⅰ、Ⅲ(ND Ⅰ、ND Ⅲ),细胞色素b(Cyt b),无机焦磷酸酶(PPase),并用实时荧光定量PCR研究各基因在红树蚬各组织内的表达情况,因为基因不稳定性,利用β-actin作为内参对各目的基因所得数据进行均一化处理。结果发现:6个基因在HBCD胁迫后都有转录且差异表达。经生物统计学分析,胁迫后鳃及肝胰腺组织中各基因的表达量较对照组中有显著变化,总体上随着胁迫天数及浓度的增加呈增加趋势,但当胁迫浓度过高时,因线粒体产生的应激能力有限,表达量反而降低。最后从酶复合物在呼吸链、ROS生成、ATP合成中的作用等各方面分析了HBCD胁迫导致线粒体基因表达变化的原因,为进一步开展分子毒理研究和开发分子生物标志物在海洋监测中的应用奠定了基础。     

海底地形图表达方法探讨

为实现海底地形多样化表示与服务,丰富海底地形图表示样式,分析了海底地形图的主要内容,研究了海底地形图可视化表达机制。结合多源海底地貌与底质数据的特点,提出了基于颜色扩展联合图形符号、可灵活组合的海底地形图表示策略,给出了水深注记、等深线、深度区、海底底质这4类主要海底地形要素的具体表达方法。试验表明,设计的可视化表达方法能实现不同类型、不同来源、不同质量差异的多类型海底地形数据的有效表达,为海底地形数据的多样化表达提供参考。