大黄鱼皮质醇无创检测技术研究

皮质醇是衡量鱼类应激状况的重要参考指标,从血液中检测皮质醇的常规方法会对鱼造成严重伤害甚至致其死亡。本实验室开发了一种从水中检测皮质醇的技术,应用该技术比较了大黄鱼高温处理组(28℃)和对照组(20℃)血清与水样中皮质醇含量的变化,结果显示血清与水样皮质醇的检测结果具有高度的一致性,且相关性显著(P 0.05),说明通过测定水样中的皮质醇来代替血清中的皮质醇是可行的。为进一步验证该方法的效果,我们又比较了机械应激前后水样中皮质醇含量变化,结果显示机械胁迫也导致了皮质醇含量的显著升高(P 0.01)。本技术的建立可为大黄鱼养殖过程中应激状态的无创检测提供参考。     

饥饿胁迫对大黄鱼激素敏感性脂肪酶和乙酰辅酶A羧化酶mRNA表达及酶活性的影响

激素敏感性脂肪酶（hormone sensitive lipase,HSL）和乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase,ACC）是脂代谢的关键酶,肌肉和肝脏是鱼类脂代谢的主要场所。为研究饥饿过程中这两种酶的作用,本实验采用实时荧光定量PCR技术以及ELISA技术检测了在35 d饥饿过程中这两种酶在大黄鱼肌肉和肝组织中mRNA表达水平和酶活性的变化。结果显示,饥饿胁迫显著降低大黄鱼肌肉和肝组织中脂肪含量,以及脂肪合成关键酶ACC mRNA表达水平（P<0.05）;显著提高脂肪分解关键酶HSL mRNA表达水平（P<0.05）。饥饿胁迫对肌肉和肝组织中HSL和ACC酶活性均有显著影响（P<0.05）,肌肉和肝组织HSL （相关系数r分别为0.598 2和0.539 6）以及肌肉组织ACC酶活性（r=0.677 7）与对应mRNA表达水平呈中度正相关（0.5 < r < 0.8）,但ACC酶活性在肝组织与其对应的mRNA表达量呈负相关（r=-0.374 0）,提示饥饿胁迫对大黄鱼HSL和ACC的表达存在翻译前和翻译后两种水平的调控。本研究结果可为研究饥饿胁迫对大黄鱼脂类代谢分子层面的影响机制提供依据。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)耐环境因子试验及其遗传力的估计

通过大黄鱼15个半同胞家系鱼苗对低盐、低溶氧和低pH值水体的抗性试验,采用半同胞组内相关法,对大黄鱼耐各环境因子遗传力进行了估计。结果表明,大黄鱼40日龄鱼苗在水体溶氧4.76—1.21mg/L时2.5—10h以内全部死亡,盐度8.05—9.03时1—30h内全部死亡,pH值4.49—5.2时1—8h内全部死亡;对耐低溶氧、低盐和低pH值的遗传力估计值分别为0.23、0.10和0.23,t检验表明对耐低溶氧和低pH值的遗传力估计达到显著水平,耐低盐遗传力的估计不显著。     

大黄鱼β2-微球蛋白基因的克隆及其在大肠杆菌中的重组表达

主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex,MHC）是一类高度多态的基因群,它广泛分布于各种脊椎动物体内,在启动特异性免疫应答中起关键作用．MHC根据结构分为Ⅰ型和Ⅱ型两种．β2-微球蛋白（β2mcroglobulin,β2m）是MHCI型分子的轻链．本文根据大黄鱼β2m的表达序列标签（expressed sequence tags,EST）序列设计合成了特异性引物,利用RT—PCR技术从大黄鱼脾脏组织中克隆了β2m基因（Pscr-β2m）;构建了合β2m因的原核表达载体（pGEX4T-2-β2m,在0．1mmol／dm^3IPTG诱导下重组β2m得到了表达;采用Sepharose 4B亲合层析纯化目的蛋白并制备了抗体;Western—blotting分析证实了该抗体具有与天然大黄鱼脾脏组织中β2m蛋白反应的特性．这些结果为进一步研究鱼类β2m构与功能的关系,以及制备MHCI类分子四聚体奠定基础．     

不同生长时期大黄鱼形态性状与体重的相关性分析

研究不同生长时期大黄鱼Pseudosciaena crocea形态性状对体重的影响效果,分别测定了1704尾13月龄和596尾20月龄闽-粤东族大黄鱼的全长(x1)、体长(x2)、体高(x3)和体重(y),计算相关系数,采用通径分析方法计算了以体重(y)为依变量、其他性状为自变量的通径系数和决定系数.结果表明,在两个不同生长时期,全长、体长、体高和体重4个性状两两之间的相关系数在0.800-0.977之间,均达到极显著水平(P<0.01);在13月龄,体高对体重的直接影响(0.522)最大,其次为体长(0.445),全长对体重的直接影响不显著(P>0.05).在20月龄,体高对体重的直接影响(0.394)最大,其次为体长(0.328)、全长(0.271),各性状对体重的直接影响均达到极显著水平(P<0.01).研究结果表明在不同生长时期,各形态性状对体重的直接影响是不同的,早期选种(13月龄)时要注意体高和体长的挑选,而在晚些时候(20月龄)选种,对体高、体长和全长均要考虑,才能够保证选择效果.     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)内脏白点病病原分离鉴定及致病性研究

于2013年4月从宁德患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)中分离得到两株优势菌NZBD9和NZBD11,这两株菌在16—19°C条件下回归感染能引起大黄鱼内脏白点病,而在7—10°C和24—27°C条件下同样的人工感染不能致病,从而证实这两株菌为大黄鱼内脏白点病的病原菌。经16S rDNA基因的测序和时间飞行质谱微生物鉴定仪分析,NZBD9和NZBD11同为变形假单胞菌。药敏性实验结果显示NZBD9对庆大霉素、诺氟沙星和四环素等7种药物高度敏感。组织病理学观察结果显示病鱼的肝脏、脾脏、头肾等组织中均出现明显病症,如变性和坏死。     

人工育苗条件下的大黄鱼胚胎发育及其仔、稚鱼形态特征与生态习性的研究

连续观察人工育苗中同一批受精卵,在水温２３．２～２３．４℃,盐度２７．００～２７．８０条件下,经过２６ｈ３６ｍｉｎ孵出仔鱼,并继续观察仔,稚鱼发育过程中的形态特征与生态习性,还比较了不同年份与不同批次的观察资料,讨论了水温等环境条件变化的对胚胎发育的影响,以及仔,稚鱼器官发育与日龄,生长速度等关系。     

溶藻弧菌脂多糖对大黄鱼的毒性与免疫保护性试验

用酚水法从20dm3大黄鱼的病原菌--溶藻弧菌菌液分离出脂多糖(LPS)溶液380cm3,冻干后得到LPS粉末97.6mg.在注射剂量为0.2cm3不同浓度LPS溶液对大黄鱼肌肉注射毒性试验中,LPS注射浓度为0.5 mg/cm3 时, 5d内能引起大黄鱼死亡;当LPS浓度提高到2 mg/cm3时,大黄鱼的死亡率达到100%.以剂量为0.2 cm3、浓度为0.2 mg/cm3的LPS溶液对大黄鱼进行免疫注射,15d后用0.2cm3浓度为9×108 个/cm3的溶藻弧菌进行攻毒试验,40%的大黄鱼获得免疫保护.