大黄鱼鳍细胞系的建立及久效磷对其毒性作用的研究

为了建市大黄鱼(Pseudosciaena crocea)鳍细胞系,为其细胞毒理学、病毒学与细胞工程等研究奠定基础,本文采用酶消化法使用含有20%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12、Leibovitz L-15和DMEM培养液(pH7.2)在22～28℃分别启动了大黄鱼鳍组织的体外培养,通过添加促细胞贴壁和分裂的物质在最适堵养条件下对大黄鱼鳍细胞进行了原代培养和继代培养,并研究了久效磷对大黄鱼细胞系鳍细胞的毒性作用.体外培养结果显示,大黄鱼鳍细胞的最适培养液为20%FBS-DMEM/F12,最适培养温度为25℃,体外培养鳍细胞的形态主要为成纤维细胞样,22 d后便可形成汇合细胞单层,经过连续继代培养成功建立了大黄鱼的连续性鳍细胞系,目前已传至第112代;对第60代大黄鱼鳍细胞系细胞的鉴定结果显示,其群体倍增时间为50.96 h,分裂状态十分旺盛,虽然出现了染色体的非整倍性,但其特征性染色体数目仍为48条,并具有正常的6m+6sm+36t二倍体核型,证明所建立的细胞系确为大黄鱼鳍细胞系.不同浓度久效磷处理的检测结果显示,大黄鱼鳍细胞对久效磷敏感,20～160 μg/mL久效磷可引起鳍细胞乙酰胆碱酯酶活性的持续性显著降低,引起超氧化物歧化酶和谷胱甘肽-S-转移酶活性的显著升高并随着浓度的升高而逐渐降低,久效磷对该细胞系细胞的48 h半抑制浓度(IC50)为43.05 μg/mL,,证实久效磷对大黄鱼鳍细胞具有显著的毒性作用.     

三联灭活细菌疫苗诱导的大黄鱼肾组织SMART cDNA文库的构建

大黄鱼(Pseudos ciaenacrocea(Richardson))是我国特有的经济鱼种,以其味道鲜美,营养丰富和极高的药用价值而受到青睐,在大黄鱼人工育苗和网箱养殖等技术相继成熟之后,人工养殖得到迅猛发展,仅福建省2000年就有养殖网箱约30万[1].由于养殖规模的不断扩大和养殖环境日益恶化,导致大面积细菌性疾病的爆发[2~5],给大黄鱼的养殖业造成了巨大的损失.对于细菌性疾病的防治,目前主要使用抗生素.     

病原性溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用研究

采用3H-TdR同位素示踪方法研究了溶藻弧菌对大黄鱼鳃黏液黏附作用.结果表明,溶藻弧菌的黏附量随着菌浓度的增加而升高并在180 min后达到饱和;在温度15~30℃、pH偏酸条件下黏附作用较强,Na+是溶藻弧菌黏附作用必需的,Ca2+起着辅助作用;溶藻弧菌经营养饥饿、热处理及高碘酸处理后黏附作用有明显下降;8种碳水化合物都有不同程度的促进溶藻弧菌的黏附作用,其中葡萄糖、甘露糖、果糖及麦芽糖有明显促进作用.研究结果表明:海水中的溶藻弧菌可很好地黏附于大黄鱼鳃黏液,其黏附作用受环境因子影响,并且与溶藻弧菌的表面碳水化合物、热敏结构等有着密切关系.     

健康与患病大黄鱼消化道微生物结构特征分析

为研究患病大黄鱼(Larimichthys crocea)消化道中可能的病原微生物,采用高通量测序技术详细分析了健康和患病大黄鱼的胃、幽门盲囊和肠道中微生物群的组成信息和分布特征。研究显示,变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门为健康和患病大黄鱼消化道的优势菌门,且其丰度在两类鱼消化道中差异显著。拟杆菌属和乳杆菌属为健康大黄鱼消化道的主要优势菌属;Aliivibrio和弧菌属则为病鱼消化道的主要优势菌属。患病鱼消化道各部位中Aliivibrio的丰度是健康大黄鱼的1702.83~10957.55倍,且差异显著。健康鱼消化道微生物参与的部分代谢通路的基因数目与病鱼样本存在显著差异。大黄鱼消化道菌群和环境菌群相似性分析及主要菌群分布特征显示,饲料中微生物群对消化道菌群的影响相对较大,说明包括饲料在内的环境微生物的卫生质量在健康养殖中的作用非常关键。通过研究推断Aliivibrio和弧菌属为主要病原菌,养殖过程中维持鱼体消化道微生物群的动态平衡对机体健康至关重要,本研究为大黄鱼健康养殖中疾病的定向防控提供了参考。     

大黄鱼库道虫病的初步研究

在广东湛江海水网箱养殖的大黄鱼 (Pseudosciaenacrocea)中发现了库道虫病 (Kudoasis) ,检出率高达 31%。其症状表现为 :白色孢囊分布于胸鳍、腹鳍、臀鳍和尾鳍等的鳍膜下 ,剖检时发现腹壁和背部肌肉中布满许多白色呈球形或椭圆形的小孢囊 ,在肠系膜、腹膜以及近口腔的粘膜上也有大量的白色小孢囊分布。镜检发现孢囊中含有典型的库道虫 ,其孢子宽为 ( 8 90± 0 55) μm ,长为 ( 8 35± 0 4 6 ) μm ,极囊宽为 ( 2 39± 0 36 ) μm ,极囊长为 ( 4 4 8± 0 39) μm。孢子在淡水中 2 0min后全部死亡 ,在盐度为 6的水体中 ,12h和 2 4h后存活率分别约为 87.4 %和 70 % ;在盐度为 16、2 6和 36的水体中 ,孢子存活率均为 10 0 % ;在盐度为 4 6的水体中 ,12h和 2 4h后存活率分别约为92 %和 84 %。孢子对低温有较强的耐受力 ,当水温达到 4 4℃时 ,8h、12h和 2 4h后 ,孢子的存活率分别约为 91%、80 .5%和 6 6 %。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)I型干扰素基因的特征与表达分析

采用RT-PCR和RACE-PCR技术克隆了大黄鱼(Larimichthys crocea)Ⅰ型干扰素基因全长cDNA序列及其基因组序列,并利用荧光定量PCR技术研究了该基因在大黄鱼不同组织中的表达谱,以及副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、LPS、polyI:C刺激后大黄鱼脾脏、肝脏和头肾组织中该基因在转录水平的表达变化。结果表明,大黄鱼Ⅰ型IFN基因全长cDNA为878bp,开放阅读框558bp,编码185个氨基酸。推测的大黄鱼Ⅰ型IFN氨基酸序列N端含有20个氨基酸的信号肽,其后包含一个保守的IFabd结构域。大黄鱼Ⅰ型IFN基因包含5个外显子,4个内含子,在大多数组织和细胞中都有表达,其中在血细胞中表达量最高,肌肉中表达量最低。PolyI:C刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏、头肾和肝脏中的表达量显著上调;LPS刺激可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在脾脏和肝脏中的表达量显著上调;灭活的副溶血弧菌可诱导大黄鱼Ⅰ型干扰素基因在头肾和肝脏中的表达量显著上调。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)精子冷冻前后的活力及超微结构变化

采用两步降温法超低温冷冻保存大黄鱼精子,并用透射电镜技术研究了精子的超微结构损伤.结果表明,大黄鱼冻精的激活率、运动时间及寿命与鲜精相比无显著差异.鲜精中28.5％的精子形态结构异常,冻精中37％的精子形态结构异常.形态结构正常的精子表现为质膜与核膜结构完整、无膨胀现象,袖套、轴丝及中心粒结构正常,线粒体形态完整、嵴较发达;形态结构异常的精子表现为质膜破裂、脱落,质膜膨胀,核膜破裂、脱落,核局部受损伤,线粒体膨胀、嵴退化或消失,线粒体移位或脱落.结果显示,以Cortland溶液为稀释液,10％ DMSO为抗冻剂,对大黄鱼精子具有较好的抗冻保护作用.     

大黄鱼溶藻弧菌病组织中巨噬细胞移动抑制因子的检测及意义

本文应用免疫组织化学方法,对健康大黄鱼和患溶藻弧菌病大黄鱼组织中巨噬细胞移动抑制因子(macrophage migration inhibitory factor,MIF)蛋白进行了检测,以研究溶藻弧菌病大黄鱼组织中MIF的表达情况及其对预后的影响。结果表明,MIF在健康大黄鱼头肾、脾、肠各组织中均无表达;MIF在溶藻弧菌病大黄鱼各组织中高表达,表达强度从弱到强依次是肠、脾、头肾,MIF表达阳性率分别为:56%、64%、92%。推测MIF在大黄鱼溶藻弧菌病发病中发挥重要作用。     

Effect of Dietary Olaquindox on the Growth of Large Yellow Croaker（Pseudosciaena crocea R.） and the Distribution of Its Residues in Fish Tissues

Olaquindox（OLA）, one of quinoxaline-N, N-dioxides, has been put under ban. However it was used as a medicinal feed additive early; it promotes the growth of livestock and prevents them from dysentery and bacterial enteritis. In this study, we evaluated the effect of dietary OLA on the growth of large yellow croaker（Pseudosciaena crocea R.） and the histological distribution of OLA and its metabolite 3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid（MQCA） in fish tissues. Four diets containing 0（control）, 42.5, 89.5 and 277.2 mg kg^-1 OLA, respectively, were formulated and tested, 3 cages（1.0 m × 1.0 m × 1.5 m） each diet and 100 juveniles（9.75 ± 0.35 g） each cage. The fish were fed to satiation twice a day at 05：00 am and 17：00 pm for 8 weeks. The survival rate of fish fed the diet containing 42.5 and 89.5 mg kg^-1 OLA was significantly higher than that of fish fed the diet containing 0 and 277.2 mg kg^-1 OLA（P 0.05）, while the weight gain rate of fish fed the diet containing 42.5 and 89.5 mg kg^-1 OLA was significantly higher than that of fish fed the diet without OLA（control）（P0.05）, but similar to that of fish fed the diet with 277.2 mg kg^-1 OLA. Fish fed the diet with 277.2 mg kg^-1 OLA had the highest content of OLA and MQCA in liver（3.44 and 0.39 mg kg^-1, respectively）, skin（0.46 and 0.09 mg kg^-1, respectively） and muscle（0.24 and 0.06 mg kg^-1, respectively）. In average, fish fed the diet containing OLA had the highest content of OLA and MQCA in liver which was followed by skin and muscle（P〈 0.05）, whereas OLA and MQCA were not detectable in control. Our findings demonstrated that OLA and MQCA accumulated in large yellow croaker when it was fed with the diet containing OLA, thus imposing a potential safety risk to human health.