节杆菌A3分裂蛋白FtsQ基因克隆及其功能预测

利用TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)方法克隆节杆菌A3 ftsq基因序列,基于生物信息学软件分别进行ftsq序列同源性分析、蛋白质FtsQ跨膜域及三级结构预测,初步预测该基因所编码蛋白FtsQ的功能.结果表明:节杆菌A3 ftsq基因全序列1035 bp,编码氨基酸344个;节杆菌A3 ftsq基因与谷氨酸棒状杆菌、结核分枝杆菌和天蓝色链霉菌ftsq亲缘关系比较近,与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、新月柄杆菌和肺炎链球菌亲缘关系比较远;节杆菌蛋白质FtsQ为一次跨膜蛋白,包括膜内域(1-114氨基酸残基)、跨膜域(115-139氨基酸残基)和膜外域(140-344氨基酸残基);空间结构预测节杆菌FtsQ膜内域和跨膜域空间结构缺失.因此,节杆菌A3 FtsQ蛋白与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌FtsQ膜内域在长度和空间结构存在显著不同,其膜内域较长,较长的膜内域段可能取代了缺失的FtsA的功能,辅助Z环的锚定和下游蛋白的吸附.当节杆菌A3处于电离、辐射、寒冷等极端环境时,ftsq或许是节杆菌生存的必须基因;当节杆菌处于实验条件温度为20℃,营养充足,ftsq则可能是非必须基因.节杆菌A3 FtsQ在细菌细胞分裂时可能通过与上游蛋白、下游蛋白相互作用,确定细胞分裂位点和速度;同时FtsQ参与合成肽聚糖,一方面,促使细胞内陷皱缩,细胞一分为二;另一方面,FtsQ合成厚厚的细胞壁以适应极端环境的需要.     

泰国斗鱼抗缪勒氏管激素(AMH)基因cDNA克隆及表达

利用RACE(Rapid-amplification of cDNA ends)克隆技术从泰国斗鱼(Betta splendens)精巢中克隆抗缪勒氏管激素(Anti-Müllerian hormone,AMH)基因的c DNA序列,分析该基因序列与其他物种的差异,并用RT-PCR半定量方法分析其组织表达的性别差异。结果表明:泰国斗鱼AMH基因的cDNA序列全长为1 804 bp,其中开放读码框为1 596 bp,编码532个氨基酸残基,与其他物种的氨基酸序列差异较大,同源性最高仅55%;AMH前体蛋白的系统进化树显示,泰国斗鱼与尖吻鲈(Lates calcarifer)亲缘关系最近;AMH基因的组织表达有明显的组织特异性及性别差异,在性腺中表达量最高,雄性个体脑、脾和肌肉次之,垂体、肝、肾、心和肠中未检测到AMH表达,雌性个体脾、心脏和肌肉次之,脑、垂、肝和肾中未检测AMH表达。     

草鱼白细胞介素6基因克隆与表达分析

白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长为1 145 bp,包含一个长为702 bp的开放阅读框,能编码233个氨基酸,预测CiIL-6的蛋白质分子质量为26.74 ku,等电点为8.72。其中5'和3'非编码区(UTR)分别为86 bp和357bp。氨基酸同源性分析显示,草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,它们的CiIL-6氨基酸同源性高达76%,而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示,CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高,而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统vscP基因的克隆与生物信息学分析

根据NCBI上登录的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列,设计一对克隆溶藻弧菌HY9901株Ⅲ型分泌系统"分子尺"蛋白VscP全长基因的特异性引物,PCR扩增获得基因的全长片段。结果显示,vsc P(Gen Bank登录号FR780678)开放阅读框ORF为1 206 bp,共编码401个氨基酸残基。根据推导的氨基酸序列预测其分子质量约为44.4 ku,等电点为5.72。Signal 4.1 Server和TMHMM Server 2.0预测结果表明,VscP无信号肽与跨膜结构域。Soft Berry-Psite预测结果显示,VscP含有3个N端糖基化位点,2个cAMP及c GMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,5个蛋白激酶C磷酸化位点,9个酪蛋白激酶II磷酸化位点,2个N端豆蔻酰基化位点,1个酰胺化位点和3个微体C末端靶信号位点。运用MEGA6.0构建的VscP系统进化树显示,溶藻弧菌VscP与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)聚为一簇。应用SWISS-MODEL软件构建VscP亚基三维结构模型发现,其与鞭毛Fil K蛋白有相似构型。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

红笛鲷IRAK-1基因克隆及哈维弧菌感染后的组织表达

用同源克隆和RACE的方法克隆红笛鲷(Lutjanus sanguineus)白细胞介素1受体相关激酶1(Interleukin-1receptor-associated kinase 1,IRAK-1)基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析其在健康鱼及哈维弧菌感染后红笛鲷的组织表达。结果表明,该序列全长3 207 bp(登录号KF728204),包含5′非编码区(UTR)202 bp,3′UTR752 bp,开放阅读框(ORF)2 253 bp,编码750个氨基酸。根据推导的氨基酸序列预测其蛋白分子质量为82.6 ku,理论等电点为6.59。IRAK-1包含1个N端死亡结构域、proST结构域、中央激酶结构域和C末端结构域。荧光定量PCR分析显示,红笛鲷IRKA-1基因在肝脏和皮肤的表达量最高,其次是心脏、鳃、肌肉和胸腺,其余组织的表达量较低。哈维弧菌侵染红笛鲷后,各组织中IRAK-1基因mRNA表达量均呈上调趋势,肝组织中变化最显著。