文蛤亮氨酸氨肽酶LAP3的基因克隆及其在幼体不同发育时期、成体不同组织的表达分析

为探索贝类LAP3基因的结构和功能特征以及在生长发育过程中的作用,利用cDNA末端快速扩增（RACE）法获得文蛤LAP3（Mm-LAP3）基因的cDNA全长序列,并对其生物信息学、组织及发育时期表达特征进行了分析。结果显示,Mm-LAP3基因cDNA全长2 037 bp,ORF区1 254 bp,编码417个氨基酸;Mm-LAP3蛋白由Peptidase_M17超家族序列的N-端结构域和Peptidase_M17催化结构域组成。荧光实时定量PCR结果表明,Mm-LAP3基因在文蛤成体6个组织和幼体10个发育时期中均有表达,其中在斧足中的表达量显著高于其他组织（P<0.05）,这与斧足蛋白含量丰富、代谢旺盛相关;在幼体10个发育时期中的表达量呈现逐渐升高的趋势,在D形幼虫时期达到最高,随后又有所降低,推测Mm-LAP3基因在早期发育时期参与了某些组织器官的形成。     

假单胞菌(Pseudomonas sp.cn4902)磷酸甘油磷酸酯酶基因克隆与鉴定

采用随机克隆、功能筛选、逐次排除和同源比较的基因克隆新策略进行克隆假单胞菌(Pseudomonas sp．cn4902)磷酸甘油磷酸酯酶基因的研究。结果表明，该结构基因长819bp，与铜绿假单胞菌的磷酸甘油磷酸酯酶基因的核苷酸一致性达61．5％，氨基酸同源性为56．2％。该基因已输入GenBank数据库，收录号AF348165。将该基因转化大肠杆菌，受体菌在含NaCl 1．0mol／L的培养基中甘油含量升高2．9倍，最终菌浓度提高3．6倍。可见这是一个与生物耐盐性相关的主基因，以其转化、培育耐盐农作物的前景十分光明。     

马氏珠母贝TRADD基因克隆与组织表达分析

【目的】克隆马氏珠母贝(Pinctada martensii)肿瘤坏死因子受体相关死亡域蛋白(TRADD)基因,并分析其在各组织中的表达。【方法】利用cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得马氏珠母贝PmTRADD基因的c DNA全长序列,利用实时荧光定量PCR(qPCR)方法分析PmTRADD基因在马氏珠母贝不同组织中的表达模式。【结果与结论】PmTRADD包含5′非编码区101 bp,3′非编码区144 bp和开放阅读框(ORF)591 bp,编码196个氨基酸。序列分析表明,PmTRADD没有信号肽和跨膜结构域,C端含有一个死亡结构域(DEATH)。将PmTRADD死亡结构域的氨基酸序列与其他物种的TRADD死亡结构域序列进行比对,发现不同物种的TRADD死亡结构域序列同源性较低。PmTRADD在马氏珠母贝各组织中均有不同程度表达,在鳃组织中表达最高,肝胰腺次之,闭壳肌中基本无表达。     

溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs的克隆、生物学信息分析及原核表达

提取溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)的总DNA,克隆溶藻弧菌胱硫醚-β-合成酶基因cbs,对其进行生物信息学分析。结果表明,所克隆溶藻弧菌cbs基因的开放阅读框为1 095 bp,编码364个氨基酸。氨基酸序列比对发现,溶藻弧菌的CBS蛋白与其他弧菌的CBS相似性极高,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)CBS氨基酸序列相似性达98%;CBS蛋白质的二级结构为典型的"α+β"折叠模式,无跨膜结构及信号肽。构建cbs基因表达载体(p GEX-cbs)以表达重组蛋白,结果显示,cbs基因在大肠杆菌BL21中高效表达,可表达出分子质量约为66.4 ku的融合蛋白。对表达条件进行优化,发现在37℃、IPTG浓度0.6 mmol/L的条件下诱导5 h后,CBS蛋白的表达量较多,该蛋白主要以包涵体形式存在。     

企鹅珍珠贝Sox9基因的克隆及表达分析

【目的】更好地了解企鹅珍珠贝性别转换机制。【方法】RACE-PCR技术克隆企鹅珍珠贝Sox9基因cDNA的全长序列,分析其理化性质和进化地位;荧光定量PCR技术分析Sox9基因在各组织及不同时期性腺中的表达特征。【结果与结论】Sox9基因cDNA序列全长2 267 bp,其中开放阅读框(ORF)为1 410 bp,编码469个氨基酸。氨基酸序列比对显示企鹅珍珠贝Sox9基因与黑蝶真珠蛤(Pinctada margaritifera)和马氏珠母贝(Pinctada fucata)有高度同源性(81%)。Sox9在企鹅珍珠贝各组织中均有表达,在足中表达量最高(P0.05),精巢中其次;Sox9在成熟期精巢检测到最大表达量(P0.05),在发育早期精巢、退化期精巢和成熟期卵巢中表达量较低,其中发育早期卵巢表达量最低(P0.05)。     

浙江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhejiangensis）凝溶胶蛋白和肌动蛋白基因的克隆与序列分析

利用已构建的浙江枝吻纽虫cDNA文库,通过PCR技术扩增得到gelsolin和actin基因的全长cDNA序列。其中,gelsolin的cDNA全长1947bp,5′-非翻译区62bp,3′-非翻译区778bp,开放阅读框1107bp,编码369个氨基酸;actin的cDNA全长为1830bp,5′-非翻译区167bp...     

凡纳滨对虾C-型凝集素LvLec2 对不同刺激的免疫应答

克隆获得了与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)C-type lectin 3同源的C-型凝集素LvLec2基因序列,并通过Real-time PCR研究了其在脂多糖(lipopolysaccharide,简称LPS)、灭活溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,简称WSSV)刺激后的转录表达变化。结果表明,LvLec2编码157个氨基酸,含有1个糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,简称CRD),其CRD结构域中具有决定糖结合特异性的基序"EPS"(Glu118-Pro119-Ser120)序列。系统进化树分析表明LvLec2与已发表的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)C-型凝集素亲缘较远。LPS、灭活溶壁微球菌和WSSV刺激后,LvLec2基因在肝胰脏中的转录表达有明显的变化但表达模式不同。LvLec2可能作为模式识别受体参与了对虾对病原的识别或防御。     

Cloning and sequence analysis of a full-length cDNA of <Emphasis Type="Italic">SmPP1cb</Emphasis> encoding turbot protein phosphatase 1 beta catalytic subunit

Reversible protein phosphorylation, catalyzed by protein kinases and phosphatases, is an important and versatile mechanism by which eukaryotic cells regulate almost all the signaling processes. Protein phosphatase 1 （PP1） is the first and well-characterized member of the protein serine/threonine phosphatase family. In the present study, a full-length cDNA encoding the beta isoform of the catalytic subunit of protein phosphatase l（PPlcb）, was for the first time isolated and sequenced from the skin tissue of flatfish turbot Scophthalmus maximus, designated SmPPlcb, by the rapid amplification of cDNA ends （RACE） technique. The cDNA sequence of SmPPlcb we obtained contains a 984 bp open reading frame （ORF）, flanked by a complete 39 bp 5＇ untranslated region and 462 bp 3＇ untranslated region. The ORF encodes a putative 327 amino acid protein, and the N-terminal section of this protein is highly acidic, Met-Ala-Glu-Gly-Glu-Leu-Asp-Val-Asp, a common feature for PP1 catalytic subunit but absent in protein phosphatase 2B （PP2B）. And its calculated molecular mass is 37 193 Da and pI 5.8. Sequence analysis indicated that, SmPPlcb is extremely conserved in both amino acid and nucleotide acid levels compared with the PPlcb of other vertebrates and invertebrates, and its Kozak motif contained in the 5＇UTR around ATG start codon is GXXAXXGXXATGG, which is different from mammalian in two positions A6 and G3, indicating the possibility of different initiation of translation in turbot, and also the 3＇UTR of SmPPlcb is highly diverse in the sequence similarity and length compared with other animals, especially zebraf＇lsh. The cloning and sequencing of SmPPlcb gene lays a good foundation for the future work on the biological functions of PP1 in the flatfish turbot.     

日本囊对虾Marsupenaeus japonicus)组织蛋白酶D基因克隆及表达分析

组织蛋白酶D是溶酶体天冬氨酸蛋白酶家族的主要成员,广泛参与动物机体细胞内蛋白质的降解过程,对维持细胞稳态和正常代谢具有重要的作用。为研究组织蛋白酶D在甲壳动物非特异性免疫和幼体发育过程中的作用,本研究采用RACE技术首次克隆得到日本囊对虾组织蛋白酶D基因cDNA序列,命名为MjCatD,其中开放阅读框长为1161 bp,编码386个氨基酸残基。序列分析和同源建模显示该基因编码的蛋白含有保守的N-糖基化位点、天冬氨酸蛋白酶签名序列、酶活化位点和非消化性组织蛋白酶D的特征序列,并且呈保守的双叶形结构。同源性比较和系统进化分析发现,MjCatD与斑节对虾、美洲螯龙虾和脊尾白虾相似性较高,并且与它们紧密聚为一支。实时荧光定量PCR结果显示,MjCatD基因在日本囊对虾多个组织中均有表达,其中肝胰腺中表达量最高。在白斑综合征病毒(white spot syndrome virus, WSSV)感染后3～24 h日本囊对虾肝胰腺中MjCatD的表达量逐渐下降,而在48 h急剧上调至最高表达量并且与对照组差异极显著(P<0.01)。此外,MjCatD基因在幼体发育不同阶段中也表现出明显的变化趋势。以上研究表明,MjCatD基因可能参与日本囊对虾先天免疫反应和幼体发育过程。     

黄鳍棘鲷IGF-2基因克隆及IGF-1/2在胚胎发育过程中的表达特性分析

类胰岛素样生长因子（Insulin-like Growth Factors,IGFs）是生物生长轴下游的关键调控因子,其对促进细胞分化与机体生长具有重要的作用。为深入研究IGF-1和IGF-2基因在黄鳍棘鲷（Acanthopagrus latus）胚胎发育过程中表达机制及可能发挥的作用,本文利用分子克隆技术分离鉴定了黄鳍棘鲷IGF-2基因cDNA序列,并对其进行了生物信息学分析。同时,在对其胚胎发育过程连续观察的基础上,利用实时荧光定量PCR的方法,测定并分析了黄鳍棘鲷胚胎发育不同时期IGF-1和IGF-2基因m RNA的表达情况。实验结果表明,IGF-2基因cDNA序列全长为1 736 bp,其中开放阅读框648 bp,共编码215个氨基酸。多重序列比对分析发现,黄鳍棘鲷IGF-2氨基酸序列与同属鲷科鱼类的大西洋鲷（Sparus aurata）相似性为99.95%,与三长棘赤鲷（Pagrus auriga）相似性为98.14%,与其他硬骨鱼类的IGF-2也有较高的相似性,显示出IGF-2在硬骨鱼类进化关系上的保守性。在水温为（26.5±0.5）℃,p H为8.0和盐度为28的条件下,...