海水双壳类受精生物学研究进展

1 研究概况,在海水双壳类中开展的大量受精生物学研究表明,绝大部分的海水双壳类为卵生型,雌雄配子被排放到海水中完成受精。排放的卵子处于第一次减数分裂前期(生发泡期)或中期。精子入卵后,受精卵恢复减数分裂,先后排放出两个极体,形成雌雄原核并最终启动卵裂。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)卵子发生、激活与早期卵裂的细胞学观察

采用连续切片和光镜技术,对三疣梭子蟹卵子发生、激活和早期卵裂进行了细胞学观察.结果表明,在发育及再发育的卵巢中,三疣梭子蟹卵子发生主要经历了卵原细胞的增殖和初级卵母细胞的分化、生长、成熟这两个阶段.依据卵子发生过程中雌性生殖细胞形态的变化,这两个阶段又可细分为卵原细胞期、卵黄发生前卵母细胞期、小生长期、大生长期、近成熟卵母细胞期和成熟卵母细胞期等6期.成熟卵母细胞处于第一次减数分裂中期,这可作为卵子成熟的形态学标志.第一次减数分裂中期纺缍体长轴的旋转可以发生于卵巢中,与精子及海水的刺激无关.初级卵母细胞达到形态和生理上都成熟的时间窗口很窄.精子入卵引起卵子的激活和减数分裂的完成.23℃下离体培养时,第一和第二极体分别在卵产出后约40min和2h释放.雄原核的形成早于雌原核.雌、雄原核在卵产出后约5h通过联合形成合子核.卵产出后约6h,受精卵处于第一次核分裂后期,但卵裂沟直到卵产出后13h才能观察到,此时核已完成了2次分裂,形成合胞体胚胎.     

大菱鲆产卵季节对卵子的生物学及生化特征的影响

于2000年6－8月，采用现场测定和生化分析方法，研究了大菱Ping雌鱼产卵盛期和产卵晚期卵子的生物学特征及生化组成。结果表明，大菱Ping卵子的生物学特征及生化组成随着产卵季节的进程而改变。产卵晚期的卵子卵径小于产卵盛期，每粒卵子含水量及重量均高于晚期，盛期卵子的粗蛋白、脂肪、灰分占干重的百分比低于晚期卵子。在产卵晚期，中性脂所产卵盛期有明显增加，而20：5（n－3）、20：4（n－6）水平比产卵盛期有明显增加，而20：5（n－3）、20：4（n－6）、22：5（n－3）和22：6（n－3）的水平则明显下降。产卵盛期卵子的孵化率和存活力要高于晚期。     

糙海参卵子发生及卵黄发生的超微结构

通过扫描与透射电镜观察了糙海参(Holothuria scabra)卵子发生及卵黄发生的过程。结果表明,糙海参卵子属于均黄卵,其卵子发生经历卵原细胞、卵黄发生前卵母细胞、卵黄发生期卵母细胞3个阶段。其中,卵黄发生期卵母细胞分别包括卵黄发生早期、中期、后期卵母细胞3个阶段。卵原细胞核大且呈椭圆形,胞质中只分布少量的线粒体;卵黄发生前卵母细胞内有一个空泡状的生发泡(卵核);卵黄发生早期,细胞器种类丰富,数量多;卵黄发生中期,卵黄合成旺盛,是内源性卵黄大量形成的阶段,多种细胞器活跃参与形成卵黄;卵黄发生后期,细胞体积最大,细胞核明显,且位于胞质中间或者靠近动物极突。高尔基体、线粒体及核糖体是形成内源性卵黄最主要的细胞器。卵质膜通过胞饮作用参与外源性卵黄的形成。本结果可为糙海参繁殖生物学和人工繁殖提供参考。     

大菱鲆卵子排放后在卵巢腔内老化特征初探

为了探明大菱鲆(Scophthalmus maximus)卵子在卵巢腔内老化的原因及特征,采用连续跟踪采卵的方式,通过荧光染色、生理生化指标测定,对不同采卵时间(0, 3, 6, 9, 12 h)的卵子活性氧和脂质过氧化情况(氧化产物丙二醛MDA)、抗氧化系统(超氧化物歧化酶SOD,还原型谷胱甘肽GSH)、卵巢液pH值及受精率和孵化率进行对比研究。结果表明,随着卵子在体内老化时间的延长,其活性氧含量及脂质过氧化程度逐渐升高,活性氧含量及过氧化程度与排卵后卵子老化呈正相关;SOD酶活力,GSH酶活力均显著下降,MDA含量显著提高;受精率和孵化率均显著下降。排卵后6h,孵化率降到2.87%～10.60%,此时的卵质已经极度恶化,不能再继续用于后续的生产中。综上,在卵巢腔中,卵子排放后,随着时间的延长,活性氧含量显著升高,抗氧化能力逐渐下降,受精率和孵化率显著降低,老化逐渐加剧。     

黑鲷（Sparus macrocephalus）成熟精,卵和精子入卵早期过程的初步观察

黑鲷精子入卵早期发育迅速。精、卵相遇的3－5sec左右,卵孔管出现一种能引诱精子入卵的物质;精卵相触约10－15sec左右,即精子进入卵孔管后,管内又涌出另一种能阻止多余精子继续入卵的物质;同时,受精锥形成。约15-54sec左右,受精膜发生;约90sec左右受精膜举起,围卵腔雏成;约180sec左右受精锥开始退缩,精子头部和颈部被俘入卵内;约300sec左右出现第二极体。文中对卵孔管出现的这两种物质进行了浅析。     

母源免疫对大菱鲆(Scophthalmus maximus)子代抗体IgM水平的影响

采用鳗弧菌灭活疫苗对大菱鲆(Scophthalmus maximus)雌性亲鱼免疫方法, 进行了母源免疫对子代抗体水平、变化规律的影响及卵子中抗体蛋白空间分布特征的研究。结果表明, 免疫亲鱼产出的卵子中IgM抗体水平显著高于对照组。胚胎发育过程中, 抗体水平整体呈下降趋势, 且48h前下降迅速, 免疫组抗体水平显著高于对照组(P<0.05); 48h以后, 免疫组和对照组间无显著差异。卵子中抗体蛋白免疫组化定位结果表明, 未受精卵中IgM抗体集中分布在卵膜内侧边缘, 卵黄部分分布不明显。研究还发现, 卵巢液中抗体水平显著高于卵子匀浆液, 且免疫亲鱼组卵巢液中抗体水平显著高于对照组(P<0.05)。本实验验证了大菱鲆特异性抗体的母源传递性, 并揭示了在本免疫条件下的传递时效, 为进一步开展通过母源免疫对育苗早期疾病防控途径的探索奠定了基础。     

光裸星虫体腔液中卵子发生的超微结构

为探究光裸星虫卵子发生的细胞学特点,利用电镜技术观察了光裸星虫体腔液中卵子发生过程的超微结构变化。结果表明:(1)光裸星虫体腔液中存在游离的卵原细胞和卵母细胞,卵母细胞的发育分为卵黄形成前期、卵黄形成初期、卵黄旺盛合成期和成熟期4个阶段。(2)卵原细胞的细胞器少,核质比大。卵黄形成前期,卵母细胞的细胞器有所增加,大量核仁外排物进入胞质中;出现卵黄膜和胶质膜,卵黄膜遍布微孔。卵黄形成初期卵母细胞核有较多突起,细胞器大量增加,出现分散分布的卵黄粒。卵黄旺盛合成期卵母细胞迅速增大,卵黄大量积累。成熟期卵母细胞核膜突起回缩,胶质膜易于脱落。(3)卵黄分为2种。Ⅰ型卵黄电子密度高,不发生融合,为内源性卵黄;II型卵黄中等电子密度,可融合为无定形卵黄块,为外源性卵黄。(4)成熟卵母细胞卵黄膜为三层,外层为颗粒层,表面具有粒状突;中层初始为均质结构,不断增厚并纤维化;内层致密,厚度不均。胶质膜电子密度极低。(5)卵子外有滤泡细胞,其核质比很大,细胞器少,在卵母细胞成熟期发生凋亡。文章还探讨了胶质膜、卵黄膜、滤泡细胞的功能,以及细胞器在卵黄形成中的作用。研究结果积累了光裸星虫卵子发生细胞学资料,为光裸星虫生殖调控与人工繁育研究提供理论参考。     

Ca2+，Mg2+，K+及胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂对中国对虾卵子激活的影响

对虾成熟卵子的激活都是由海水引起的,海水的刺激引起成熟的卵母细胞发生皮层反应,完成减数分裂,这一过程同有无精子的作用无关(Clark et al.,1977,1980; Lynn et al.,1991; Pillai et al.,1987)。在对锐脊单肢虾(Sicyonia ingentis)的卵子激活研究中发现,其成熟卵子无论受精与否在接触海水以后均具有相同的激活过程,受精卵和未受精卵的皮层反应及减数分裂的恢复没有区别,而海水中刺激卵子发生皮层反应直接因子是Mg2+而不是Ca2+。在无Mg2+人工海水中,锐脊单肢虾的卵子不能激活;而在无Ca2+人工海水中,卵子则可正常激活(Pillai et al.,1987; Lindsay et al.,1992a)。Mg2+对锯额长臂虾(Palaemon serratus)卵子减数分裂的形响的研究表明,锯额长臂虾卵子减数分裂的恢复必须有Mg2+参与,而Ca2+则是非必须的;胞外Mg2+可以诱导卵子的皮层反应,并使卵膜外的微绒毛消失;胞外Mg2+的增加可使卵子内部游离Ca2+浓度发生变化,从而诱导卵子的激活(Goudeau et al.,1986,1991,1996)。 根据前人的报道,胰蛋白酶和胰蛋白抑制剂对对虾精子的顶体反应、卵子的激活都具有明显的影响(Lynn et al.,1987; Griffin et al.,1990; Lindsay et al.,1992b; Chen et al.,1994)。Lynn等(1987)报道褐对虾(Penaeus aztecus)的卵胶前体(jelly procusor)含有约70%-75%的蛋白质及25%-30%的多糖,胰蛋白酶对于人工分离的卵胶前体具有明显的降解作用,胰蛋白酶抑制剂可以抑制卵子在海水中的激活,Griffin等(1990)的研究发现,锐脊单肢虾的卵子内含有类胰蛋白酶的物质,解剖性成熟雌虾获得的卵子置入海水摇匀,上清液-卵水(egg water)可以诱导取自雌虾纳精囊内的精子发生顶体反应,胰蛋白酶也可以诱导对虾精子的顶体反应,而胰蛋白酶抑制剂则完全可以抑制对虾精子在人工海水中发生顶体反应时顶体丝的形成。Lindsay等(1992b)的研究也得出了类似的结果,并对卵水和胰蛋白酶不同浓度及不同作用时间下对对虾精子顶体反应的诱导作用进行比较研究。Chen等(1994)对锐脊单肢虾精子的提取物进行生化分析发现,精子内部也有类胰蛋白酶的物质,并通过免疫电镜技术将其进行定位,精子的提取物可以降解分离的卵黄膜。 激光扫描共聚焦显微镜(Laser scanning confocal microscope)在海洋动物的受精及发育生物学的研究中已有一些报道(Sardet et al.,1992; Stricker et al.,1992; Shen et al.,1993; Jaffe, et al.,1994; Malinda, et al.,1994)。而在对虾的受精及发育生物学方面应用还比较少,只有锐脊单肢虾的卵子激活及早期发育的研究上有一些报道(Hertzler et al., 1992, 1994: Lindsay et al.,1992a)。 海水中的离子成分是影响卵子激活的关键因子,而胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂对对虾受精也有着很大影响,这两方面的工作在国内、外中国对虾的受精生物学研究中均未见报道。 作者对上述两类理化因子对中国对虾卵子激活的影响进行研究,并使用激光扫描共聚焦显微镜对中国对虾卵子受胰蛋白酶和胰蛋白酶抑制剂的作用而发生的形态变化进行研究,初步分析了造成异常卵裂的原因。     

大黄鱼Pseudosciaena crocea (Richardson)卵子和仔、稚鱼的形态特征

关于大黄鱼卵子和仔、稚鱼的形态特征,过去已有一些记载,但对很多阶段的描述还不齐全,使鉴定工作遇到不少困难。1958和1959年我们在浙江和广东近海进行了卵子和仔、稚鱼的形态观察,同时,还做了卵子恒温发育的初步试验; 1960年又搜集了补充资料,为开展大黄鱼生殖习性和早期生活阶段生态研究提供了基本资料。大黄鱼与小黄鱼等卵子和仔、稚鱼的形态很相似,不易分辨,本文中亦一并作了比较。 本文是在导师张孝威教授指导下完成的,吴尚勤副教授提供了宝贵意见,丁正凰和陈富宝同志曾参加海上采集工作,范守安同志协助分析海水;此外,浙江鱼山岛渔业生产大队、广东硇洲岛洲岛渔业生产大队和我所的"水星号"稠查船船长及船员协助了海上工作,在此特致感谢。