栉孔扇贝精巢组织细胞的体外培养及特征分析

本研究建立了一个栉孔扇贝精巢组织细胞的原代培养体系,鉴定了原代细胞的功能基因表达特征。结果显示,原代培养体系中的精巢细胞以圆形细胞为主,直径为4~11μm,其在体外已存活9个月以上。使用栉孔扇贝vasa基因(生殖细胞标记基因)的地高辛RNA探针和原位杂交技术检测,约98%的原代细胞呈阳性。利用免疫组化技术鉴定了栉孔扇贝SCP3、KLF4、PIWI、C-MYC、SOX9和SOX17在这些细胞中的表达特征,发现这些靶蛋白在精巢原代细胞中的表达特征与栉孔扇贝精巢中的细胞定位基本一致。上述结果表明,本实验所获得的原代细胞以生殖细胞为主,它们保留了栉孔扇贝雄性生殖细胞原有的基因表达特征,可以用于贝类精子发生和性别相关的功能基因研究。     

石油烃暴露对栉孔扇贝组织Wnt4基因表达的影响

采用荧光定量PCR的方法测定了不同浓度石油烃暴露下栉孔扇贝各组织Wnt4基因相对表达量的变化,结果表明,栉孔扇贝各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃影响下变化程度具有明显差异,对照组表达量大小顺序为精巢>卵巢>鳃丝>消化盲囊;在浓度为0.1mg·L^-1石油烃影响下,除鳃丝Wnt4基因表达量有上升趋势之外,其余各组织均无显著变化(P>0.05);而在0.3mg·L^-1及以上石油烃浓度组,四种组织Wnt4基因表达量随暴露时间均出现明显上升或者被抑制的现象(P<0.05),各组织Wnt4基因被激活和被抑制的时间和程度均有不同,受石油烃暴露影响的程度为鳃丝>卵巢>精巢>消化盲囊。本研究认为0.3mg·L-1及以上浓度石油烃暴露对栉孔扇贝各组织特别是鳃丝Wnt4基因表达量的影响较大,对栉孔扇贝的生长发育影响明显;各组织Wnt4基因表达量在不同浓度石油烃的影响下呈现一定的规律性,其变化跟各组织解毒指标的变化具有一定相似性,是较好的反映栉孔扇贝在石油烃暴露下其生长发育变化程度的生物学指标。     

基于Cyt b基因序列的南海北部蓝圆鲹群体遗传多样性研究

为了解南海北部蓝圆鲹(Decapterus maruadsi)的群体遗传变异特征,本研究利用线粒体DNA Cyt b基因部分序列对9个群体共203个个体进行群体遗传多样性和遗传结构分析.结果显示:在722 bp长的Cyt b部分序列中,共检测出52个多态位点,定义25个单倍型;群体的单倍型多样性(h)为0.577±0.036,核苷酸多样性(π)为0.001 55±0.001 12,整体遗传多样性呈中等偏低水平,其中雷州半岛和海南岛以东5个群体的遗传多样性水平明显高于以西的4个北部湾群体.单倍型系统发育树和网络图均未表现出与地理位置相对应的谱系结构,单倍型网络图呈以主体单倍型为中心的星状结构.群体间的Fst值为-0.077~0.018,且统计检验均不显著(p0.05).分子方差分析(AMOVA)表明,遗传变异全部来源于群体内个体间.Tajima's D值和Fu's Fs值均为显著负值,核苷酸不配对分布呈明显的单峰分布.南海北部蓝圆鲹群体约在29 000a前可能发生过扩张事件,导致遗传多样性呈现高h、低π模式;9个群体间的遗传分化并不显著,符合是一个随机交配种群的假设,但9个群体的遗传多样性水平却表现出明显的地理趋势,提示将南海北部蓝圆鲹作为单一种群进行渔业管理需持谨慎态度.     

四株鳖源致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的表型、分子鉴定及其毒力基因检测

采用生态毒理学、表观分类学及分子生物学方法,对具白底板病典型症状濒死中华鳖内脏中分离获得的4株病原菌开展了以致病性、表型分析、分子鉴定及毒力基因检测为内容的实验研究,结果表明:(1)4株病原菌均具致病性,致死力由大到小依次为ZHYYZ-2、ZHYYZ-4、ZHYYZ-1、ZHYYZ-3;(2)4株病原菌均为呈短杆状、具溶血活性的革兰氏阴性细菌,VITEK2型全自动细菌鉴定与药敏系统和ATBExpression型细菌鉴定与药敏智能系统均显示为嗜水气单胞菌;(3)ZHYYZ-1、ZHYYZ-2、ZHYYZ-3、ZHYYZ-4的16SrDNA序列长度分别为1460、1464、1466、1461,经Blast同源性检索表明它们所扩增的16SrDNA序列与GenBank数据库中登记的71株嗜水气单胞菌的相似性均为99%;(4)经PCR特异性检测,各实验菌均含有Aha、AHH、AerA和OMP。根据4株实验菌的表型和分子生物学特征,判定它们均为气单胞菌属的致病性嗜水气单胞菌。     

凡纳滨对虾C-型凝集素LvLec2 对不同刺激的免疫应答

克隆获得了与中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)C-type lectin 3同源的C-型凝集素LvLec2基因序列,并通过Real-time PCR研究了其在脂多糖(lipopolysaccharide,简称LPS)、灭活溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)和白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,简称WSSV)刺激后的转录表达变化。结果表明,LvLec2编码157个氨基酸,含有1个糖识别结构域(carbohydrate recognition domain,简称CRD),其CRD结构域中具有决定糖结合特异性的基序"EPS"(Glu118-Pro119-Ser120)序列。系统进化树分析表明LvLec2与已发表的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)C-型凝集素亲缘较远。LPS、灭活溶壁微球菌和WSSV刺激后,LvLec2基因在肝胰脏中的转录表达有明显的变化但表达模式不同。LvLec2可能作为模式识别受体参与了对虾对病原的识别或防御。     

Cloning and phylogenetic analysis of a fatty acid elongase gene from Nannochloropsis oculata CS179

Nannochloropsis oculata CS179, a unicellular marine microalga, is rich in long-chain polyunsaturated fatty acids (LCPUFAs). Elongase and desaturase play a key role in the biosynthesis of PUFAs. A new elongase gene, which encodes 322 amino acids, was identified via RT-PCR and 5′ and 3′ RACE. The sequence of the elongase gene was blast-searched in the NCBI GenBank and showed a similarity to those of the cryptosporidium. But the NJ-tree revealed that the N. oculata CS179 elongase clustered with those of the microalgae Phaeodactylum tricornutum, Ostreococcus tauri and Thalassiosira pseudonana.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)病原副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的表型及分子特征

采用常规的形态及生理生化特性检验及分子生物学等方法,对引起凡纳滨对虾幼虾发生毁灭性死亡的病原菌进行了致病性、表型生物学及分子生物学的系统研究。结果表明,分离菌为弧菌属(Vibrio Pacini 1954)的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),对凡纳滨对虾、中国对虾及日本对虾仔虾均有强致病性。分离鉴定的4株副溶血弧菌具有淀粉酶、明胶酶、卵磷脂酶活性,但不具有蛋白酶、脂肪酶活性,KP溶血均呈阴性,且均具有K抗原;代表菌株(JGB080708-1株)的16S rRNA基因序列(长度为1456bp,GenBank登录号为GQ205448)和gyrB基因序列(长度为1195bp,GenBank登录号为GQ205453)与副溶血弧菌的两种基因序列相似性均可达98%以上。病原菌的耐药性检测结果显示,对供试49种抗菌药物中的林可霉素等6种药物耐药。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)的表型与分子鉴定

从江苏连云港某养殖场养殖死亡的泥鳅肝脏、血液及腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对泥鳅具有很强的致病性。采用表观分类学及分子生物学方法,对分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶活性及溶血活性等生物学性状检验;用PCR方法同时扩增其16SrRNA和gyrB基因,分析了16SrRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,通过基因序列分析,比较了两种基因在相似细菌的检测和鉴定能力;基于16SrRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌(LD081008B-1)所扩增的16SrRNA和gyrB基因序列均与GenBank数据库中霍乱弧菌具有较高的相似性,且gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;16SrRNA基因序列长度为1446bp(GenBank登录号:GQ205447),gyrB基因序列长度为1207bp(GenBank登录号:GQ205452);根据分离菌的表型特征及分子特征,判定病原菌为弧菌属(VibrioPacini1854)的霍乱弧菌(Vibriocholerae)。胞外酶活性及溶血活性检测表明分离菌均具有蛋白酶、卵磷脂酶、淀粉酶、明胶酶及DNA酶活性,在含7%家兔脱纤血...     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为:头部、鳃盖及鳍基出血,尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属(Listonella MacDonell and Colwell 1986)的鳗利斯顿氏菌[Listonella anguillarum (Bergeman 1909) MacDonell and Colwell 1986]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

Molecular ecological study of <Emphasis Type="Italic">Siganus spinus</Emphasis> and <Emphasis Type="Italic">S. guttatus</Emphasis> from Okinawan waters based on mitochondrial DNA control region sequences

The mitochondrial DNA (mtDNA) control region was sequenced to examine the genetic variability and gene flow of juvenile Siganus spinus and S. guttatus. In total, 461 nucleotide sequences were obtained from 69 specimens of juvenile S. spinus from Okinawa Island and Ishigaki Island, in which 17 variable sites and 22 haplotypes were identified. Haplotype diversity (h) was high (0.9244 in Okinawa and 0.8984 in Ishigaki), whereas nucleotide diversity (π) was low (0.0063 in Okinawa and 0.0059 in Ishigaki). The two populations were not genetically distinct. Siganus guttatus, which do not form large schools at recruitment, in contrast S. spinus, were also analyzed by studying 152 individuals collected off Okinawa Island, Miyako Island, and Ishigaki Island. Of 476 nucleotide sequences, 50 were variable, and 42 haplotypes were identified. Genetic variability values were high (h = 0.8766 and π = 0.0151 in Okinawa; h = 0.9640 and π = 0.0192 in Miyako; h = 0.9161 and π = 0.0199 in Ishigaki). The Okinawa population was genetically isolated from the Miyako and Ishigaki populations. As a result, genetic diversity was high for each of these siganid populations despite their being target species for fisheries; however, the degree of inter-population gene flow was higher for S. spinus than S. guttatus, suggesting that these species exhibit different dispersal strategies.