印度洋深海热液区可培养细菌的分子鉴定与系统发育分析

采用MMJHS寡营养培养基从印度洋深海热液区沉积物和热液硫化物中分离获得16株细菌,通过16S rDNA序列比对和生理生化分析,对它们进行了鉴定并构建了系统发育树.结果表明,12株细菌属于γ-变型菌(γ-Gammaproteobacteria),其中6株属于盐单胞菌属(Halomonas),4株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter),2株属于食碱菌属(Alcanivorax);其余4株属于芽孢杆菌(Bacillus),其中1株为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis).分离获得的16株细菌中,4株为革兰氏阳性细菌,12株为革兰氏阴性细菌;H2S反应、吲哚测定反应、M.R和V-P均呈阴性.本研究为深入认识和开发利用深海热液区微生物资源奠定了基础.     

文昌鱼嘌呤代谢酶基因:结构与演化

嘌呤代谢是动物含氮废物排出体外的重要途径之一.嘌呤代谢终产物在不同动物各不相同.这是由于进化过程中,参与代谢1种或多种酶基因或者酶活性的丢失所致.本文从JGI网站佛罗里达文昌鱼基因组数据库中搜索文昌鱼参与嘌呤代谢主要5种酶(黄嘌呤脱氢酶、尿酸酶、尿囊素酶、尿囊酸酶、尿素酶)的基因,并且将它们与其他12种具有代表性且基因组序列已知的动物包括人、小鼠、狗、鸡、爪蟾、河豚、斑马鱼、海鞘、海胆、果蝇、线虫、海葵的基因结构进行比较.结果发现文昌鱼参与嘌呤代谢的酶基因有的和脊椎动物基因相似(黄嘌呤脱氢酶和尿酸酶),有的和脊椎动物与无脊椎动物的基因都不相似(尿囊酸酶),还有的和无脊椎动物海胆与海葵基因外显子个数与内含子相位都相似但外显子之间缺乏对应关系(尿素酶).所有这些都支持文昌鱼代表脊椎动物始祖代表类型,同时兼具特化特征的观点.尿素酶基因存在于水生无脊椎动物中,而在陆生的果蝇和线虫中均未发现尿素酶基因,因而我们推测随着动物由水生向陆生进化,参与尿素分解的尿素酶基因可能在陆生动物中完全丢失.     

东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因的定量检测

建立了检测东海原甲藻线粒体细胞色素b(Cytb)基因mRNA含量的实时荧光定量PCR方法.以甲藻Cytb基因的简并引物扩增得到984 bp长的东海原甲藻Cytb基因片段,经克隆、测序,制备并纯化质粒.以光度法测定质粒浓度并作为标准品.对上述基因片段,利用PRIMER EXPRESS 3.0 设计引物,以梯度稀释的质粒标准品进行定量PCR反应,以SYBR Green I为荧光染料,制作标准曲线,得到基因拷贝数X与Ct值的关系为:Ct=-3.50 lg X+39.35(相关系数r为0.999).通过对不同生长时期的东海原甲藻样品的Cytb基因mRNA含量检测,发现该基因的表达量较稳定,平均值为(45.4±4.7)拷贝/细胞,受生长状态影响不大,可作为实时荧光定量PCR的内参基因.     

两个奥利亚罗非鱼群体热休克蛋白70基因序列比对分析

采用RACE技术,对两个奥利亚罗非鱼群体(Oreochromis aurea)(美国奥利亚和中国奥利亚)热休克蛋白Hsp70基因完整编码区(code sequences,CDS)cDNA的进行克隆测序。序列分析结果表明:两个奥利亚罗非鱼群体热休克蛋白Hsp70基因CDS序列完全相同,全长1 923 bp,编码640个氨基酸,相对分子质量为70.29×103,理论等电点5.462,均具有Hsp70家族的3个签名序列:IDLGTTYS、IFDLGGGTFD、VVLVGGSTRIPKIQK;核定位信号标签KRKHKKDISQNKRALRR;Dank特征基序DLGTT-S-V;胞质Hsp70特征基序EEVD;靠近C端的GGMP4肽序列;2个糖基化位点NKSI和NVSA。对所得基因序列与已发表的青锵(Oryzias latipes)等物种Hsp70基因的氨基酸序列进行同源性比较,发现两个奥利亚罗非鱼群体与莫桑比克罗非鱼最高99.4%,与牙鲆最低83.9%;系统进化树分析表明奥利亚罗非鱼的Hsp70 cDNA序列与青鳉等物种的Hsp70基因聚在一支,而与牙鲆的Hsp70基因相分离。     

我国海域两种大型水母的分子鉴定

采用通用引物-PCR扩增法,测定了辽宁营口海蜇成体的部分16S基因序列578bp、部分COI基因序列633bp,以及黄海海域沙海蜇成体部分COI基因序列645bp、部分16S基因序列479bp.结果表明,海蜇个体间的16S序列只有一个变异位点,其余序列完全一致;COI序列共有4个变异位点,碱基之间只存在转换,没有颠换、插入或缺失的位点.沙海蜇个体间的COI序列碱基组成完全一致,16S序列碱基组成也完全一致.从辽宁盘锦和山东胶州所取的水母碟状体和稚水母的测序结果显示,COI序列与海蜇成体的差异为0.5%-0.6%,与沙海蜇成体的差异为18.9%-19.4%;16S序列与海蜇成体的差异为0.0%-0.2%,与沙海蜇成体的差异为13.1%-13.3%.以上结果表明,水母碟状体和稚水母都为海蜇而非沙海蜇.结合GenBank中已有的其它水母类COI基因同源序列信息,构建分子系统发育树.结果显示:轮环水母亚目(Kolpophorae)和指环水母亚目(Daktyliophorae)以及有肩板族(Scapulatae)和无肩板族(Inscapulatae)的分类划分,与传统分类一致.从分子水平上证明,在黄海海域采集的沙海蜇和在日本采集的越前水母的差异只处于种内水平,两者应为同物异名.     

半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究半滑舌鳎病原鳗利斯顿氏菌表型及分子特征研究

2008年12月,江苏赣榆某渔场养殖半滑舌鳎出现大量死亡,症状主要表现为：头部、鳃盖及鳍基出血, 尾鳍腐烂,腹腔膨胀并积有大量腹水,部分病鱼肠管脱出肛外。从病鱼肝脏、腹水中分离出大量优势生长的 细菌,人工感染试验证明其对半滑舌鳎有较强的致病性。对3株分离菌进行了形态特征、理化特性、胞外酶及溶血素活性等表型生物学性状检验;测定了代表菌株的16S rRNA和gyrB基因序列,分析了16 S rRNA和gyrB两种基因序列的同源性,并构建了系统发生树,比较了两种基因对分离菌的鉴定能力;结果表明gyrB基因用于细菌种间鉴定更具优越性;基于16S rRNA和gyrB基因的系统发育学分析表明分离菌与鳗利斯顿氏菌具有高同源性,根据分离菌的表型及分子特征,判定分离菌为利斯顿氏菌属（Listonella MacDonell and Colwell 1986）的鳗利斯顿氏菌\[Listonella anguillarum ( Bergeman 1909)MacDonell and Colwell 1986\]。胞外酶活性及溶血活性检测表明3株分离菌均具有淀粉酶、蛋白酶、卵磷脂酶等胞外酶活性,在含7%家兔脱纤血液营养琼脂培养基上呈β型溶血,PCR检测3株供试菌均可扩增出大小约493 bp的溶血素基因和大小约248 bp的金属蛋白酶基因。分离菌的耐药谱测定结果显示,对供试49种抗菌药物中的青霉素G等13种药物耐药,对羧苄青霉素等6种药物存在敏感与耐药的株间差异。     

碱蓬PEPCase基因的克隆与分析

采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术首次获得碱蓬(Suaeda glauca)中含PEPCase基因完整编码区的cDNA序列,长度为3 038 bp.获得的序列采用生物信息学方法和系统进化方法进行分析.结果表明,获得的cDNA序列包含2 898 bp的完整开放阅读框,编码的966个氨基酸序列含有两个PEPCase活性位点以及6种其他的活性位点;预测蛋白质的相对分子质量为109 785.3,等电点为5.51,属于不稳定的亲水性蛋白;含量相对较多的氨基酸是Leu、Glu、Arg、Asp、Ser,不含Pyl和Sec;不包含跨膜结构和信号肽序列,推断为非分泌性蛋白;二级结构以α螺旋为主,三级结构为紧密球状结构;分析结果还表明获得的碱蓬PEPCase基因应该属于C3型.通过对碱蓬PEPCase基因的克隆及序列分析从而为后期碱蓬PEPCase蛋白表达的研究及获得高油量的转基因碱蓬植株奠定了基础.     

冈村枝管藻叶绿体psbA基因的克隆及序列分析

psbA基因编码光合系统Ⅱ反应中心的D1蛋白,是叶绿体基因组中一个重要的光调控基因.根据网管藻(Dictyosiphon foeniculaceus)、髋藻(Myelophycus simplex)、粗粒藻(Asperococcus fistulosus)、索藻(Chordaria flagelliformis)、点叶藻(Punctaria latifolia)、水云(Ectocarpus siliculosus)、铁钉菜(Ishige okamurae)、绳藻(Colpomenia sinuosa)、网胰藻(Hydroclathrus clathratus)、幅叶藻(Petalonia fascia)等10种藻类的psbA基因高度保守序列,设计引物,利用PCR方法从冈村枝管藻(Cladosiphon okamuranus)基因组DNA中扩增出约750 bp的片段,将该片段连接到pMD18-T载体上进行序列测定.结果表明:片段长度为737bp,推导的245个氨基酸序列与网管藻、髋藻、粗粒藻、索藻、点叶藻、水云、铁钉菜、绳藻、网胰藻、幅叶藻的D1蛋白相对应的氨基酸序列的同源性均高于96%.该基因序列已被GenBank收录,登录号为EU332142.     

福建沿海巨蛎属牡蛎的主要种类及其分布

本实验采用了多重种类特异性PCR（multiplex species—specific PCR）技术,研究了巨蛎属（Crassostrea）牡蛎主要种类在福建沿海的分布．从沿海11个采样地点共采集了657个野生牡蛎样本,随机抽取了327个牡蛎样本进行基因组DNA的提取和线粒体COI基因的鉴定,结果发现200个个体为葡萄牙牡蛎（Crassostrea angulata）,101个个体为近江牡蛎（Crassostrea ariakensis）,20个个体为熊本牡蛎（Crassostrea sikamea）,6个个体为香港巨牡蛎（Crassostrea hongkongensis）．此次实验中未发现长牡蛎（Crassostrea gigas）．结果表明,福建沿海有葡萄牙牡蛎、近江牡蛎、熊本牡蛎和香港巨牡蛎4种巨蛎属牡蛎分布．     

北极新奥尔松地区藻类可培养附生细菌多样性研究

为南南北南地区海洋藻类可培养附生细菌的多样性,利用稀释平板法自2019年7月采集的北南新奥尔松地区的海洋红藻多管藻(Polysiphonia sp.)样品中分离纯化得到60株可培养的藻类附生细菌.16S rRNA基因序列测定分析表明所分离的藻类附生细菌主要隶属于 γ-变形菌纲(39株,65％),其次隶属于放线菌纲(10...