曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)血蓝蛋白酚氧化酶样活性研究和相关功能单元片段的克隆

采用分光光度法对曼氏无针乌贼血蓝蛋白及相关功能单元(FUs)的酚氧化酶活性进行研究,并获得该功能单元的序列信息.结果表明,曼氏无针乌贼血蓝蛋白能氧化左旋多巴和邻苯二酚而不能氧化酪氨酸单酚,说明该血蓝蛋白可能具有酚氧化酶活性,并属于儿茶酚酶类;进一步研究显示,曼氏无针乌贼血蓝蛋白酶解片段FUg的酶活特性显著区别于其它功能...     

鳜鱼（Siniperca chuatsi）幽门垂中两种胰蛋白酶的cDNA克隆及其生物信息学分析

采用RT-PCR、3′-RACE及5′-RACE技术从鳜鱼幽门垂组织中克隆了两种胰蛋白酶（分别命名为TRS-A与TRS-B）cDNA全长序列。将测序结果递交GenBank数据库,分别获得登录号为ACD70339和ACD70340。采用生物信息学的方法和工具预测了鳜鱼胰蛋白酶的理化参数及其高级结构,并构建了系统进化树。结...     

密斑刺鲀(Diodon hystrix)gnrh基因的克隆及表达分析

密斑刺鲀(Diodonhystrix)不仅具有食用价值,同时也是传统的中药及保健食品,但目前关于密斑刺鲀的生殖内分泌调控研究较少,限制了密斑刺鲀的人工繁育基础理论的发展。总所周知,促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)是生殖内分泌调控的关键因子之一。利用转录组分析及分子克隆技术,获得密斑刺鲀促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone,GnRH) gnrh2和gnrh3基因的cDNA开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)序列,并利用生物信息学的方法,获得密斑刺鲀gnrh2 cDNA开放阅读框共279 bp,可编码92个氨基酸残基;密斑刺鲀gnrh3cDNA开放阅读框共270 bp,可编码89个氨基酸残基。通过系统进化分析表明,密斑刺鲀GnRH与鲀科类的鱼具有较近的亲缘关系。通过聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)半定量的方法检测gnrh2和gnrh3基因在密斑刺鲀各组织中的分布,结果发现gnrh2和gnrh3基因在脾、鳃和垂体中的表达量较高,而在心脏中的表达量最低。此外,利用实时荧光定量的方法检测了密斑刺鲀gnrh2和gnrh3基因在性腺发育不同时期的表达模式,结果显示密斑刺鲀gnrh2基因在不同的性腺发育时期中没有显著性的变化,而gnrh3基因随着性腺发育成熟而不断升高。研究主要获得两个创新性的重要结果:首先是证实了密斑刺鲀存在两种gnrh基因(gnrh2和gnrh3),其次是提示了gnrh3基因可能是密斑刺鲀生殖调控的主要gnrh类型。研究结果可为深入研究密斑刺鲀生殖内分泌调控机理提供研究方向和基础。     

马氏珠母贝热休克蛋白HSP60基因的克隆与表达分析

运用cDNA末端快速扩增（RACE）技术,克隆马氏珠母贝（Pinctadamαrtensii）热休克蛋白HSP60基因 cDNA全序列。序列全长2495坤,开放阅读框（ORF） 1734坤,编码577个氨基酸,预测的分子量约为61.79阳, 理论等电点为5.4905＇非翻译区（ 5＇UTR）长150坤, 3＇非翻译区（3＇UTR）长611 bp。同源性比对分析结果,马 氏珠母贝HSP60基因与与太平洋长牡妨（Crωsos仰a gIgω）和光滑双蹄螺（Biomphalaria glabrata）的同源性较 高,达到75%。氨基酸序列分析显示,马氏珠母贝HSP60氨基酸序列具有典型的rnt-HSP60特征序列、C-末端典型的GGM重复基序和一个ATP结合结构域。荧光定量数据分析发现,该基因在闭壳肌、外套腹、血淋巴、肝膜腺、性腺、躁、等6个组织中具有表达,在肝膜腺中表达量最高,腮中次之,而在血液和闭壳肌中仅有少量表达;在脂多糖剌激后,该基因表达水平上调,12 h后达到最大值,之后又逐渐下调,均高于对照组,差异具统计学意 义（P〈0.05）。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)PP2A调节亚基B的基因克隆与表达分析

采用RT-PCR、RACE等方法,获得了拟穴青蟹PP2A调节亚基B(PP2A-B)的cDNA全序列,全长2040bp,开放阅读框(ORF)为1332bp,可编码443个氨基酸残基。同源分析显示,该基因编码的蛋白与其它一些物种具有很高相似性,推测PP2A-B基因具有很高的保守性。经荧光定量PCR检测,PP2A-B基因在拟穴青蟹多个组织中有表达,且在脑、卵巢、鳃中表达量较高。在拟穴青蟹卵巢发育过程中,PP2A-B基因在卵巢未发育期(I期)表达量最高,此后各期逐渐下降,推测PP2A-B在卵巢中可能以PP2A全酶的形式存在,抑制卵巢发育。     

节杆菌A3分裂蛋白FtsQ基因克隆及其功能预测

利用TAIL-PCR(Thermal Asymmetric Interlaced PCR)方法克隆节杆菌A3 ftsq基因序列,基于生物信息学软件分别进行ftsq序列同源性分析、蛋白质FtsQ跨膜域及三级结构预测,初步预测该基因所编码蛋白FtsQ的功能.结果表明:节杆菌A3 ftsq基因全序列1035 bp,编码氨基酸344个;节杆菌A3 ftsq基因与谷氨酸棒状杆菌、结核分枝杆菌和天蓝色链霉菌ftsq亲缘关系比较近,与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、新月柄杆菌和肺炎链球菌亲缘关系比较远;节杆菌蛋白质FtsQ为一次跨膜蛋白,包括膜内域(1-114氨基酸残基)、跨膜域(115-139氨基酸残基)和膜外域(140-344氨基酸残基);空间结构预测节杆菌FtsQ膜内域和跨膜域空间结构缺失.因此,节杆菌A3 FtsQ蛋白与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌FtsQ膜内域在长度和空间结构存在显著不同,其膜内域较长,较长的膜内域段可能取代了缺失的FtsA的功能,辅助Z环的锚定和下游蛋白的吸附.当节杆菌A3处于电离、辐射、寒冷等极端环境时,ftsq或许是节杆菌生存的必须基因;当节杆菌处于实验条件温度为20℃,营养充足,ftsq则可能是非必须基因.节杆菌A3 FtsQ在细菌细胞分裂时可能通过与上游蛋白、下游蛋白相互作用,确定细胞分裂位点和速度;同时FtsQ参与合成肽聚糖,一方面,促使细胞内陷皱缩,细胞一分为二;另一方面,FtsQ合成厚厚的细胞壁以适应极端环境的需要.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及重组表达

采用EST结合RACE技术进行了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型GST(SmGST)基因的克隆。结果表明,该基因的cDNA全长为838bp,其中5′非编码区为73bp,3′非编码区为150bp,开放阅读框为615bp,编码的蛋白含有204个氨基酸。该基因的氨基酸序列中包含1个典型的GST-N结构域和一个GST-C结构域,与栉孔扇贝和长牡蛎的sigma-型GST的相似度分别为40.3%和39.3%。将该基因的编码区重组到pET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达。重组SmGST的GST活力为(12.22±0.92)U/mg蛋白。     

凡纳滨对虾碱性磷酸酶和酸性磷酸酶基因的克隆、表达及盐度应答效应

本研究通过c DNA末端快速扩增法(RACE)首次克隆得到凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)和酸性磷酸酶(acid phosphatase,ACP)基因的c DNA全长序列,其中ALP基因全长序列1 910 bp,编码536个氨基酸;ACP基因全长序列1 544 bp,编码439个氨基酸。盐度调控设3个盐度组:31(对照)、16和3。养殖45 d后,荧光定量PCR测定对虾肝胰腺、肌肉、胃、肠和鳃5个组织中的ALP和ACP基因m RNA的表达情况。RT-PCR显示,ALP基因在5个组织中普遍表达,在肝胰腺中表达量最高(P0.05),肠道中的表达量最低(P0.05);ACP基因在5个组织中也均表达,在肝胰腺和鳃中表达量明显高于其他3个组织(P0.05)。盐度应答实验表明,不同盐度条件下,不同组织中,ALP和ACP基因存在不同的表达模式。在胃和鳃组织中,ALP基因在31盐度组的表达量显著高于其他两组(P0.05);在肝胰腺和肠道中,ALP基因在16盐度下的表达量明显低于其他两组(P0.05);在肌肉中,ALP基因的表达与其他组织均不同,31盐度组表达量最高,而16盐度组最低(P0.05);在肝胰腺中,ACP基因在31盐度组的表达量明显低于其他盐度组(P0.05);在肌肉和鳃两个组织中,ACP基因在31盐度下的表达量明显高于其余两个盐度组(P0.05);在肠道中,ACP基因的表达量在3盐度组明显高于其他两组(P0.05);而在胃中,ACP基因在3个盐度下的表达量没有显著性差异。上述结果为研究低盐条件下凡纳滨对虾的磷酸酶基因的变化机制提供了参考。     

大黄鱼EBI3基因的克隆与表达分析

通过克隆大黄鱼(Larimichthys crocea)的EBI3(Epstein-Barr virus-induced gene 3)基因并对其进行了序列分析.大黄鱼EBI3(Lyc EBI3)基因开放阅读框长747bp,编码248个氨基酸,存在1个信号肽序列和2个FN3结构域(37~130,145~230).多序列比对发现Lyc EBI3分子与其他已知EBI3氨基酸水平一致性为27.68%~57.53%.Real-time PCR结果表明,Lyc EBI3基因在脾脏和血液中表达量最高,且溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)刺激后,大黄鱼头肾和脾脏中Lyc EBI3基因的转录水平会显著升高,说明Lyc EBI3基因可能参与了抑制由细菌引起的炎症反应.