大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)I 型Crustin抗菌肽的基因克隆与真核重组表达

Crustin 是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽, 主要由甲壳类血淋巴细胞合成。本研究采用RACE 技术和真核表达技术, 进行了三疣梭子蟹Crustin 基因的克隆和重组表达研究。结果表明, 在三疣梭子蟹血细胞Crustin 基因cDNA 全序列中, 开放阅读框编码110个氨基酸残基的Crustin 前体, Crustin 前体由N 端21 个氨基酸残基的信号肽、富含Cys 结构域和C端WAP 结构域三部分组成, 属于I 型Crustin, 构建的分泌型真核表达质粒pVT102U/α-crustin 转化酿酒酵母S78, 经RT-PCR 和SDS-PAGE 电泳验证, 表明重组Crustin 表达成功。     

南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。     

菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白基因克隆及Cd~(2+)胁迫下的表达分析

金属硫蛋白(Metallothionein,MT)是一类富含半胱氨酸的小分子蛋白质,参与机体重金属解毒和金属元素代谢等生理过程。本研究采用RACE技术,克隆获得了菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)金属硫蛋白(RpMT)的全长cDNA序列。RpMT的cDNA全长为570bp,编码75个氨基酸,包含15个MT所特有的Cys-Xn-Cys结构。采用实时荧光定量PCR技术,分析了两种壳色菲律宾蛤仔(白蛤和斑马蛤)RpMT基因在Cd2+暴露后的表达变化。结果发现:Cd2+急性和亚慢性暴露均可导致两种壳色蛤仔消化腺和鳃组织RpMT基因表达量的显著上调;暴露后两种壳色蛤仔鳃组织RpMT基因表达量的增加幅度均高于消化腺组织,且以白蛤鳃组织基因表达水平的上调幅度较高。上述结果表明,RpMT可能在菲律宾蛤仔抵御Cd2+胁迫过程中发挥了重要作用。     

口虾蛄高血糖激素基因全长cDNA的克隆及表达分析

本文首次采用RACE技术获得口虾蛄(Oratosquilla oratoria)眼柄部高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone,CHH)基因cDNA全长序列,共2 421 bp,5'UTR长度为180 bp,3'UTR 为1 821 bp,开放阅读框(ORF)长420 bp,编码139个氨基酸。预测蛋白二级结构α-螺旋23.74%,延伸链占23.02%,无规则卷曲占53.24%,预测分子量为15.47 kD,等电点(pI)为7.049。CHH成熟肽包含6个CHH家族中位置保守的Cys残基,C端为GK,推断为ES型CHH基因。聚类分析表明:口虾蛄CHH和十足目CHH聚为同一个分支的两亚群,具有较近的亲缘关系。荧光定量PCR分析结果表明,CHH基因在肠中表达量最高,在眼柄、触角中有较高的表达量,在肌肉中表达量相对较低,在卵巢中表达最低,而在精巢中不表达。     

CLONINGAND EXPRESSION OF TWO GENES ENCODING TYPE I CRUSTACEAN HYPERGLYCEMIC HORMONE FAMILY FROM THE MUD CRAB SCYLLA

采用RT-PCR及RACE技术,从拟穴青蟹眼柄组织中克隆了两种I型高血糖激素CHH基因（分别命名为C1与C2）cDNA全序列。序列分析结果表明：Cl基因全长1859bp,开放阅读框长420bp,编码139个氨基酸,分子量为15．326kDa,等电点为5．540;C2基因全长1739bp,开放阅读框长426bp,编码141个氨基酸,分子量为15．621kDa,等电点为7．618。与其它物种CHH氨基酸序列进行同源性比较分析显示,拟穴青蟹CHH基因与榄绿青蟹CHH基因同源性最高（92％）,依次为日本鲟（80％）、三疣梭子蟹（78％）。聚类分析表明,拟穴青蟹CHH氨基酸序列与榄绿青蟹和日本鲟紧密聚为一支。经荧光定量检测,拟穴青蟹CHH基因在眼柄、肝胰腺、心脏、肠中表达量较高,鳃、胃中表达量很少,肌肉中表达极少。盐度骤变试验结果表明：盐度胁迫24h后,c2的表达量是C1的30倍以上;C2基因盐度5时与对照组的表达量差异不显著（P〉0．05）,盐度15时差异显著（P〈0．05）,盐度22、25、30时差异极显著（P〈0．01）;盐度变化越大,C2的表达量越大。上述结果为进一步深入研究CHH基因的功能及调控机理奠定基础。     

太平洋牡蛎内切葡聚糖酶基因的克隆、序列特性和表达分析

内切葡聚糖酶是一种重要的纤维素酶,在纤维素水解过程中起到重要作用。本实验利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE)克隆获得了太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)内切葡聚糖酶基因,并对其基因结构和系统进化进行了分析。内切葡聚糖酶cDNA全长802bp,开放阅读框架630bp,编码209个氨基酸。基因组DNA全长505 6bp,含有两段内含子长度分别为205 3和231 3bp。cDNA具有与已发现的内切葡聚糖酶基因相同的保守区结构和功能域,并且与其他已知贝类的内切葡聚糖酶有较高的同源性。利用RT-PCR方法研究了该基因在太平洋牡蛎消化腺、外套膜、鳃、肌肉、性腺和唇瓣组织中的表达,发现内切葡聚糖酶基因仅在消化腺中表达,而在其他组织中没有表达。