五种鲤科鱼类生长激素cDNA的克隆和序列分析

通过RT-PCR方法,以草鱼、鳙鱼、鲫鱼、鲤鱼、齐口裂腹鱼等5种鲤科重要经济鱼类的垂体总RNA为模板扩增出其生长激素(fish growth hormone,fGH)的完整ORF序列,并克隆到pMD18-T载体上,命名为pMD-1(草鱼)、pMD-2(鳙鱼)、pMD-3(鲫鱼)、pMD-4(鲤鱼)、pMD-5(齐口裂腹鱼)。测序结果显示,ORF序列其长度均为633 bp。序列分析表明,所有ORF序列均以ATG为起始密码,以TAG为终止密码,编码210个氨基酸残基,推导的生长激素前体由22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽组成。同源性分析表明,草鱼、鳙鱼、鲤鱼、鲫鱼和齐口裂腹鱼的fGH同源性在93.3%~99.5%之间。     

中国对虾6种组织cDNA文库的构建

以中国对虾血液、眼柄、卵巢、雌虾头胸部、雄虾头胸部和三倍体对虾头胸部组织为材料,采用异硫氰酸胍-酸酚法提取总RNA;用磁珠法纯化mRNA;用Uni ZAP cDNA合成试剂盒合成双链cDNA并进行修饰,将cDNA定向连接在UniZAP载体上;经Gigapack Gold Package包装试剂盒包装成为噬菌体颗粒,转染宿主XL1 Blue MRF’菌株细胞,形成初级文库.初级文库经转染进一步扩增,形成稳定的cDNA文库.6个文库的库容在0.2×106~1.3×106之间,重组率都超过90%.从各文库随机取出6~10个清晰的噬菌斑进行PCR扩增,用琼脂糖凝胶电泳检测,其插入片段长度为500~2500bp.由初步功能基因克隆获得阳性结果.多项指标表明,所构建的对虾cDNA文库质量较高,为进一步筛选目的基因、EST测序和制作基因芯片提供了有效的工具.     

红螯螯虾网格蛋白轻链的克隆及制备抗体的检测

网格蛋白为三脚蛋白复合体,其介导的内吞作用是病毒侵染细胞的常用途径之一.而对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业的主要病原,为了研究分析WSSV的侵染机制及进入宿主细胞的途径,在本研究中,克隆得到红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)网格蛋白轻链的c DNA全长,并将其命名为Cq CLC(Genbank登录号为KR075008).进化树分析表明,其与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的网格蛋白轻链进化距离较近.此外,在其蛋白序列中选择抗原性较好的片段合成多肽,并以此制备单克隆抗体,而后经免疫荧光和western blot检测从中筛选出具有特异性的抗体,为进一步对WSSV侵染虾细胞机制及入胞途径的研究奠定了基础.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因的克隆与表达分析

白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)是一种抗炎细胞因子,可以抑制机体免疫反应。本研究经过分析大黄鱼基因组数据库发现了IL-10同源基因,并对其cDNA编码区序列和基因组DNA序列进行了克隆分析。大黄鱼IL-10(LycIL-10)基因由5个外显子和4个内含子构成,其序列全长1 869bp,其开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸,其N端的22个氨基酸残基为预测的信号肽,成熟肽由162个氨基酸残基组成,包含了脊椎动物IL-10标志性保守序列。LycIL-10的氨基酸序列同其他已知物种的IL-10氨基酸序列的一致性为26.49%~77.01%。Real-time PCR分析发现LycIL-10在检测的组织中为组成型表达,在脾脏和肌肉中转录水平相对较高。三联灭活细菌疫苗和聚肌苷酸胞苷酸(poly(I∶C))刺激后,大黄鱼头肾和脾脏中LycIL-10mRNA的转录水平会显著升高,表明LycIL-10可能参与抑制大黄鱼由细菌和病毒引起的炎症反应。     

污水处理系统中活性污泥细菌多样性研究

采用分子生物学手段16S rDNA克隆文库方法对北京高碑店污水处理厂回流污泥中的细菌进行了多样性研究。结果表明,活性污泥系统中细菌群落具有高度多样性,所有克隆子分属5个不同的细菌类群,优势细菌类群为变形菌(proteobacteria),占克隆文库的76.7%;细菌类群优势依次为β-变形菌类群(β-proteobac-teria,占39.8%)、不可培养菌类群(uncultured bacteria,占22.33%)、γ-变形菌类群(γ-proteobacteria,占20.15%)、α-变形菌类群(α-proteobacteria,占6.79%)和δ-变形菌类群(δ-proteobacteria,占4.85%);活性污泥中起硝化作用的主要是亚硝化单胞菌(Nitrosomonas sp.,占1.94%)和硝化螺旋菌(uncultured Nitrospirae bacterium,占11.65%),由于这2种硝化菌自身生长缓慢,难以与异养细菌竞争,以致其在文库中的比例较低;而作为反硝化细菌的陶厄氏菌属在文库中的比例却高达27.18%,可见该活性污泥具有较强的反硝化能力;克隆文库中还发现了少量的玫瑰单胞菌属(占4.85%),推测它的存在和有机磷的降解有关。     

蛋白核小球藻核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶小亚基部分基因序列的克隆与分析

以单细胞绿藻蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)(藻株编号为NMBluh015-1)为实验材料,利用几种绿藻中的核酮糖-1,5-二磷酸羧化/加氧酶(Rubisco)的小亚基(rbcS)的保守序列,设计简并引物,克隆到rbcS的一条cDNA(245 bp)和3条DNA序列(其编号为CP1、CP2和CP3,长度依次为1425 bp、810 bp、705 bp)。序列比较结果表明,该蛋白核小球藻rbcS cDNA核苷酸序列与普通小球藻(C.vulgaris)、杜氏藻(Dunaliella tertiolecta)(rbcS1和rbcS2)及蛋白核小球藻"太阳小球藻"株的相似性依次为93%、92%(91%)和90%,而其编码的氨基酸序列与杜氏藻相似性最高(80%);3条rbcS DNA序列与绿藻及高等植物rbcS部分序列表现了较高的同源性,其中2条DNA(CP2和CP3)部分区段同源性很高。实验结果表明扩增得到的cDNA和DNA序列为蛋白核小球藻rbcS基因。     

钝顶螺旋藻基因组质粒文库的构建及其在获得功能基因上的应用

利用改良的SDS法提取钝顶螺旋藻基因组DNA,经Sau3AI酶切,回收1～2kb大小的片段,与BamHI（Sau3AI的同尾酶）酶切并去磷酸化后的pBR322质粒载体相连接,转入大肠杆菌（Escherichia coli）Top10细胞,构建了螺旋藻基因组质粒文库。根据pBR322载体上多克隆位点两侧序列设计锚定引物,根据丝状蓝藻丝氨酸／苏氨酸激酶（STK）保守序列设计简并引物,以螺旋藻质粒文库为模板,“巢式”扩增出了STK基因部分序列。螺旋藻基因组质粒文库的构建为功能基因研究提供了极大方便。     

大黄鱼(Pseudosciaena crocea)细胞色素 P450 CYP4F7基因的克隆及表达分析

CYP4F7是细胞色素P450超基因家族中CYP4F亚家族中的同工酶之一,而细胞色素P450在通过电子传递参与生物体代谢和转化内源和外源化合物方面起着重要的作用。以本实验室构建的大黄鱼消减杂交cDNA文库中623bp的CYP4F7片段设计引物,以大黄鱼的总RNA为模板,利用RACE-PCR的方法,克隆鉴定出了大黄鱼细胞色素P450 CYP4F7基因。结果表明:基因全长1934bp,5'端非编码区59bp,3'端非编码区264bp,开放阅读框1611bp,编码536个氨基酸。序列分析表明大黄鱼的CYP4F7氨基酸序列与舌齿鲈的相似性为91%。利用RT-PCR方法研究CYP4F7在大黄鱼各组织中的表达特征,结果表明CYP4F7在肝脏、脾脏中表达量最高,在心脏、肾脏、头肾、鳃丝中表达量次之。另外,CYP4F7在注射了细菌脂多糖的大黄鱼各组织中的表达量均低于正常的大黄鱼,认为细菌脂多糖可能是CYP4F7表达的抑制剂,说明CYP4F7可能与鱼类免疫反应有一定相关性。     

可口革囊星虫(Phascoloma esculenta)铁结合蛋白基因的研究

根据已报道的铁结合蛋白基因的保守序列设计引物,用cDNA末端快速扩增(RACE)法,成功地从可口革囊星虫体液中获得铁结合蛋白基因的全长序列.结果表明,该基因cDNA全长1017bp,5'-端非编码区为15lbp,3'一非编码区为341bp,开放阅读框长度为525bp(括一个终止密码子),可编码175个氨基酸(GenBank:EU091352).该序列与加洲海兔、皱纹盘鲍、刺参、微小牛蜱、叉尾鲴、非洲爪蟾、小家鼠、人等的铁结合蛋白基因有67%-75%的同源性,而相应的氨基酸同源性为59%-76%.氨基酸相似性为74%*-89%%.分析结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中是高度保守的.     

基于克隆选择原理的核爆地震特征选择方法

为了解决核爆地震自动识别中最优特征子集的选择问题,根据克隆选择原理,提出了一种过滤与封装相结合的特征选择方法.该方法融合了封装式与过滤式特征选择方法的优点,利用局部化的类别可分性判据来处理核爆地震样本的多峰分布问题,通过设定独立的记忆抗体能够保证最终结果是搜索过的最佳特征组合,并且可以处理设定和不设定最优特征子集维数两种情况下的特征选择问题.首先通过UCI数据集中呈多峰分布的玻璃数据验证了该特征选择方法的有效性,进而将其应用到核爆地震特征选择中.核爆地震特征选择实验结果表明,该方法不仅有效地降低了特征空间的维数,而且使分类精度提高了2个百分点,与封装式特征选择方法相比,该方法的计算复杂度大为降低.