4种笛鲷属鱼类mtDNA的RFLP研究

用RFLP(限制性片段长度多态性,Restriction fragment length polymorphism)技术研究了红鳍笛鲷Lutjanus erythropterus Bloch、紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus Forskal、勒氏笛鲷Lutja-nus russelli Bleeker和约氏笛鲷Lutjanus johni Bloch的遗传多样性关系,检测到4种笛鲷的分子标记。通过差速离心、核酸酶消化、苯酚抽提,从4种笛鲷肝脏组织中分离纯化线粒体DNA(mtDNA),用19种5到6碱基对的限制性内切酶进行单酶、双酶和部分酶切,琼脂糖凝胶电泳,进行了RFLP分析,构建了4种笛鲷mtDNA的物理图谱。红鳍笛鲷、紫红笛鲷、勒氏笛鲷和约氏笛鲷的mtDNA大小分别为17.36±0.09kb、17.58±0.08kb、17.50±0.18kb和17.56±0.12kb。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间平均mtDNA多态度π为0.106 2,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.130 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.151 5,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间平均mtD-NA多态度π为0.130 3,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.119 5,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间平均mtDNA多态度π为0.139 4。红鳍笛鲷和紫红笛鲷种群间净遗传距离Pnet为0.102 0,红鳍笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.128 5,红鳍笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.149 1,紫红笛鲷和勒氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.127 0,紫红笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.115 7,勒氏笛鲷和约氏笛鲷群体间净遗传距离Pnet为0.137 8。     

紫红笛鲷繁殖特性及诱导产卵的初步研究

描述紫红笛鲷Lutjanusargentimaculatus繁殖特性及人工诱导产卵的试验结果。紫红笛鲷养殖群体具有不完全的先雄后雌的性转化现象。1、2龄鱼全部为雄鱼,性腺成熟系数(GSI)为2.07%—4.85%;3龄亲鱼80%为雄鱼,20%转化为雌雄同体;4龄亲鱼性别转化基本确定,多数亲鱼为纯粹具有生殖机能的雄鱼,而在雌雄同体的亲鱼性腺中具有明显雌性第一性征的雌鱼仅占30%左右;雌雄同体的亲鱼性腺GSI为4.12%—8.09%,其中的卵巢GSI小于2%,4龄雌鱼怀卵量约70—100万粒;紫红笛鲷卵母细胞属非同步性发育,一个生殖季节能多次产卵。试验结果表明:低剂量的LHRH A2(3μg·kg-1)多次注射能有效地促进性腺发育、逐步成熟,并最终产卵,但对卵径小于300μm的亲鱼卵巢没有明显的诱导效果。在5μgLHRH A2+1000I UHCG·kg-1或5μgLHRH A2+500IUHCG·kg-1两种不同剂量的混合激素作用下,亲鱼的性腺都能迅速发育成熟,并能在小型循环式产卵池中自然产卵和受精。在水温为26.0—29.5℃的产卵池中,激素效应时间为35—43h。LHRH A2和HCG混合激素对卵母细胞直径达到400μm以上的紫红笛鲷亲鱼具有良好的促熟和催产效果,催产率达100%。如何减轻亲鱼之间相互残杀是改善雄鱼生理状况、保证雄鱼质量和提高卵子受精率必需解决的重要问题。     

红鳍笛鲷外周血细胞的显微结构观察

报道了红鳍笛鲷(Lutjanus erythopterus)外周血细胞的显微结构,血涂片经过Wright染色液染色,可区分出:红血细胞、血栓细胞、嗜中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞等5种血细胞,无嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞。白血细胞中:血栓细胞体积最小,单核细胞体积最大;血栓细胞数目最多,嗜中性粒细胞和单核细胞数目最少;淋巴细胞有大中小3种类型:大淋巴细胞、中淋巴细胞和小淋巴细胞。此外,在外周血液中还观察到少量幼稚的红细胞,偶而可见正在分裂的红细胞,提示红细胞也可在外周血直接分裂。     

紫红笛鲷线粒体全序列与笛鲷属鱼类分化年代的贝叶斯分析

利用常规 PCR 未纯化产物直接测序的方法,获得紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)全长为16543 bp 线粒体 DNA 全序列, GenBank 登录号为 JN182927.结合 GenBank 中的已有数据比较分析表明:紫红笛鲷与笛鲷属(Lutjanus)线粒体基因组成基本一致,符合脊椎动物的特征,各基因间进化速率差异显著;13个蛋白编码基因拼接序列贝叶斯建树的后验率显著高于单基因或全序列,更适用于笛鲷属的贝叶斯法系统分化分析和年代推断;13个蛋白编码基因及其拼接序列进行的系统进化分析均支持紫红笛鲷与勒氏笛鲷(Lutjanus russellii)及海鸡母笛鲷(Lutjanus rivulatus)亲缘关系较近;基于13个蛋白编码基因拼接序列的贝叶斯松散分子钟推算出笛鲷属鱼类两个主要支系大约在61.5Ma 前古新世的达宁阶与蒙蒂阶交界时期发生分化.     

紫红笛鲷遗传多样性的AFLP分析

针对广东、海南省4个不同地方(阳江、湛江、榆林、琼海)网箱养殖的紫红笛鲷(Lutjanus argentimaculatus)群体和在三亚采集的野生紫红笛鲷群体,利用AFLP分子标记技术分析我国南方养殖的紫红笛鲷的遗传多态性。最适合的AFLP引物组合是E AGC／M CAA,扩增出的AFLP特征位点为107,养殖样品扩增出的AFLP的带数在5474之间,野生样品扩增出的AFLP的带数为63,4个养殖点紫红笛鲷的多态性标记百分率都超过了40．00％,呈现一定程度的遗传多样性。总的来讲,4个养殖地的紫红笛鲷群体之间的遗传距离差异较小,但与野生群体的遗传距离相对较大,UPGMA聚类分析明显将养殖群体与野生群体分开,表明紫红笛鲷养殖群体已经与野生群体存在一定程度的遗传隔阂。     

抗紫红笛鲷血清免疫球蛋白单克隆抗体的制备

采用蛋白A－sephrose亲和层析法，分离提纯了紫红笛鲷Lutjanus argentimaculatus的血清免疫球蛋白（Ig)，并制备了抗紫红笛鲷血清Ig分子的单克隆抗体。经间接ELISA，免疫印迹（western blotting)的检测和鉴定，得到抗紫红笛鲷Ig分子重链的单抗6株，分别为IgG11株，IgG23株，IgG2a1株，IgG31株。这6株抗紫红笛鲷Ig的单抗各有1株与同为鲈形目的青石斑鱼Epinephelus awoara和尖吻鲈Lates calcarifer的Ig分子有很弱的交叉反应，而同鲽形目的牙PingParalichthys olivaceus的Ig分子没有交叉反应，具有较强的种间特异性；同时揭示，同目不同属的鱼类血清Ig之间的相似度较低，不同目之间的相似度极低。     

南海海域4种笛鲷的微卫星DNA分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,从20对西大西洋笛鲷(Lutjanus campechanus)的微卫星引物中筛选适用于红鳍笛鲷(L.erythopterus)、勒氏笛鲷(L.russellii)、紫红笛鲷(L.argentimaculatus)和约氏笛鲷(L.johnii)基因组分析的微卫星引物,分析4种笛鲷的遗传多样性及系统发生。经反应条件的优化,从20对引物中筛选出17对可稳定扩增出特异片段的引物。通过测序证实扩增产物含微卫星位点后,以该17对引物对4个种的群体进行遗传多样性分析。其中16对可在约氏笛鲷、勒氏笛鲷、紫红笛鲷基因组中扩增出重复性好的特异性条带,分别有65%、65%、60%呈现出种内多态;15对可在红鳍笛鲷中扩增出重复性好的特异性条带,并且全部呈现出种内多态。四种笛鲷中,红鳍笛鲷的多态性最高,高度多态基因座占检测座位的66.67%;勒氏笛鲷的多态性最低,低度多态基因座占43.75%。获得3个种间特异性分子标记。用DS和DA两种方法计算4种笛鲷的遗传距离,构建了系统发生树。     

融合蛋白IL6-OmpW的质粒构建及表达纯化

以重组质粒pMD18-T/IL6和pMD18-T/OmpW为模板,分别扩增红笛鲷IL-6基因和哈维氏弧菌外膜蛋白OmpW基因,运用PCR重叠延伸剪切技术,将IL-6和OmpW基因融合,将融合基因定向克隆到原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导融合蛋白高效表达,融合蛋白分子质量约为66.6 ku。优化后表达条件为温度37℃,IPTG浓度0.2 mmol·L-1,诱导时间5 h。用HisTrap HP亲和柱纯化重组蛋白,最佳咪唑洗脱浓度为400 mmol·L-1,纯化蛋白的质量浓度为480μg·mL-1。Western-blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异反应,表明目的蛋白得以正确表达。