一例异育银鲫(Carassius auratus gibelio)暴发性出血病病原分析

2016年6月,江苏某异育银鲫(Carassius auratus gibelio)养殖场暴发一种传染性急性出血病,造成养殖银鲫大量死亡。为分析此次疾病病因及流行规律,本研究从发病养殖场采集患出血病的异育银鲫,从细菌、病毒及寄生虫三个方面对病原进行了分析。采用病原菌分离、组织病理学观察、超薄切片电镜观察、病毒核酸分析、回感实验等对病原进行鉴定。结果显示从发病鲫鱼体内分离到病毒一株,未发现寄生虫及细菌感染。经测序及序列分析,该病毒为鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus2,CyHV-2)病毒,组织病理学观察结果显示患病鱼的鳃和肾脏有明显病变,电镜下可观察到病鱼脾脏组织有带囊膜的球形病毒,囊膜直径约为170—200nm,病毒衣壳直径约为110—120nm,核心直径约为60nm,用组织匀浆感染鲫鱼囊胚细胞系(CGB)可稳定地观察到典型的细胞病变,用患病鱼组织匀浆液人工感染异育银鲫的死亡率高达100%,荧光定量PCR检测到该病毒可感染多器官,其中以脾脏中病毒含量最高,其次是脑,肝脏中最少。本研究可为CyHV-2的诊断防控及疫苗研制提供资料。     

三疣梭子蟹几丁质酶基因(PtCht6)的克隆及其在免疫中的功能分析

几丁质酶(chitinase)在甲壳动物的蜕皮、消化和免疫等很多生物学过程中发挥重要功能,为深入探讨几丁质酶的免疫防御机制,本实验利用RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)PtCht6基因。该基因cDNA全长2736bp,开放阅读框(ORF)2103bp,编码700个氨基酸,具有几丁质酶GH18家族典型特征。利用实时荧光定量技术分析PtCht6在三疣梭子蟹不同组织、不同蜕皮阶段、不同病原感染以及低盐胁迫(11)下的表达特征,结果显示:PtCht6在各组织中均有表达且在肝胰腺中的表达量最高;在不同蜕皮时期的肝胰腺中,其表达量由蜕皮后期(A/B)、蜕皮间期(C)、蜕皮前期(D)依次递减(P0.05);人工感染WSSV和副溶血弧菌后.PtCht6的表达量在肝胰腺中分别于12h、72h达到最大值,在血细胞中均于12h达到最大值,且相较于对照组,整体显著上调表达(P0.05);低盐胁迫能够显著抑制该基因的表达,最高抑制73倍(P0.05)。同时发现,低盐环境下感染WSSV后,该基因达到峰值的时间明显延迟(至少延迟12h.P0.05)。该研究结果预示PtCht6作为免疫因子参与三疣梭子蟹的病原防御,且低盐胁迫在一定程度上抑制了该基因的免疫功能。     

福州市地表温度热点及时空变化分析

中国作为世界第一大发展中国家,近年来城镇化发展迅速,大量自然地表转化为人工地表,从而引起了一系列环境问题,其中以城市热岛问题最为显著。因此如何缓解因城市化进程的加快引起的城市热岛效应已成为热门研究方向。为精确分析城市空间格局对热集聚的影响,本研究利用2000年5月4日的Landsat ETM+和2016年7月27日获取的Landsat OLI两期遥感影像,获取福州市的土地覆盖信息并进行精度验证。在地表温度（Land Surface Temperature, LST）反演基础上通过热点分析（Getis-Ord Gi*）,并结合不透水面（Impervious Surface Area, ISA）信息来研究城市化进程中福州市16 年来 LST的变化特性,空间集聚特性及其产生的尺度效应。热点分析结果显示：① 通过分析福州市内各地和热点中心的距离与LST的关系可较好地反映空间热聚集。2000 年在距热点中心0.97、1.03、0.95 km范围内热聚集明显;2016 年则增长到分别在距热点中心半径1.89、2.01、2.10、2.05、2.13 km范围内热集聚显著且热点区数量也从3 个增加至5 个。热集聚区（热点区和较热区）总面积在此期间从15.7%增至47.3%;② 由于热点图中的热点区和冷点区的形成不单取决于LST的高低,因此热点分析与空间自相关分析方法相比,能更直观地分析土地覆盖变化对LST的影响,了解城市内部热强度变化的细节。本研究采用的热点分析方法可用于城市环境保护与规划,将来还可作为城市土地规划与热环境影响的分析依据。同时可利用热点分析图模拟城市微气候,估算城市绿地降温程度等。此外,未来还可基于此进一步探讨更多时相以及不同城市的对比分析,特别是对不同城市类型如带状城市,多中心城市及中心城市等的研究。     

养殖杂色鲍暴发病超微病理学研究

从1999年至2002年在中国南方沿海许多养殖场的杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)出现了严重的疾病,该病可感染各种规格的鲍,死亡很快,死亡率高。病鲍的外观症状表现为外套膜收缩,腹足表面变黑,肌肉变得僵硬。通过电镜观察,在肝胰腺、外套膜、肾、鳃及肠等组织中发现了一种球状病毒。病毒粒子大小为100～130nm。该病毒一般存在于间质细胞的细胞质中,为双层质膜所包裹。染病鲍细胞器如滑面内质网扩张、线粒体崩解,糖原粒、核糖体减少,核膜松疏、溶解、消失,核质边缘化。病毒的病原性通过对健康鲍的感染试验得到证实。     

Expression of putative zinc-finger protein lcn61 gene in lymphocystis disease virus China （LCDV-cn） genome

An open reading frame (lcn61) of lymphocystis disease virus China (LCDV-cn), probably responsible for encoding putative zinc-finger proteins was amplified and inserted into pET24a (+) vector. Then it expressed in E. coli BL21 (DE3), and His-tag fusion protein of high yield was obtained. It was found that the fusion protein existed in E. coli mainly as inclusion bodies. The bioinformatics analysis indicates that LCN61 is C2H2 type zinc-finger protein containing four C2H2 zinc-finger motifs. This work provides a theory for functional research of lcn61 gene. Supported by High Technology Research and Development Program of China (863 Program, No. 2006AA100309)     

White spot syndrome virus envelope protein VP124 involved in the virus infection

White spot syndrome virus （WSSV） is one of the major shrimp pathogens causing large economic losses to shrimp farming. In an attempt to identify the envelope proteins involved in the virus infection, purified WSSV virions were mixed with three antisera against WSSV envelope proteins （VP39, VP124 and VP187 ）, individually. And then they were injected intramuscularly into crayfish （Procambarus clarkii） to conduct in vivo neutralization assays. The results showed that for groups injected with virions only and groups injected with the mixture of virions and antiserum against VP124, the crayfish mortalities were 100% and 60% on the 8th day postinfection, individually. The virus infection could be delayed or neutralized by antibody against the envelope protein VP124. Quantitative PCR was used to further investigate the influence of three antisera described above on the virus infection. The results showed that the antiserum against VP124 could restrain the propagation of WSSV in crayfish. All of the results suggested that the viral envelope protein VP124 played a role in WSSV infection.     

原位杂交技术在斜带石斑鱼神经坏死病毒检测中的应用

根据斜带石斑鱼（Epinephelus coioids）神经坏死病毒（orang-spotted nervous necrosis virus,0GNNV）的主衣壳蛋白（major capsid protein,MCP）基因的保守序列,设计一对引物,从感染0GNNV的斜带石斑鱼组织匀浆液提取RNA为模板进行RT-PCR扩增,得到426bp的cDNA片断。用得到的RT-PCR产物加上地高辛（DIG）标记作为核酸探针。通过注射病毒提取液人工感染一组斜带石斑鱼,解剖感染病毒的斜带石斑鱼,从中分离出脑和眼睛,运用原位杂交技术检测组织中的OGNNV。实验表明,原位杂交具有较高的灵敏性和特异性,可以用原位杂交的办法来检测养殖的石斑鱼是否有携带该病毒,达到监控和预防神经坏死病爆发的目的。本实验还采用了H＆E染色方法检测了感染NNV的石斑鱼脑部和眼部组织,观察细胞内的坏死部分。与原位杂交做对比,提高了检测的可靠性和准确性。本实验建立的石斑鱼神经坏死病毒的ISH检测方法有着较高的特异性和敏感性,易于操作,有助于石斑鱼神经坏死病毒的组织定位、发病机理的研究。     

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用.细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性.细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性.不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的.     

应用巢式逆转录聚合酶链反应检测鱼类病毒性出血性败血症病毒(VHSV)

参照鱼类病毒性出血性败血症病毒序列,根据PCR引物设计的原则,设计巢式PCR引物,采用巢式逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法,对如何快速检测鱼类病毒性出血性败血症病的方法进行了较为系统的研究,并对RT-PCR的反应条件进行了优化.结果表明,巢式RT-PCR扩增获得279bp的特异性片断,阴性对照无扩增条带.巢式RT-PCR扩增出的特异性片段经测序分析,结果证实与报道的序列完全一致.该方法最低可检测出0.1pg的鱼类病毒性出血性败血症病毒RNA.初步建立了VHSV的巢式RT-PCR检测方法,该方法灵敏、特异,可为VHSV的检测提供一个快速、有效的手段.