红鳍东方鲀(Takifugu rubrips)病原杀对虾弧菌的主要生物学特性研究

采用表观分类学及分子生物学方法,对从发病的养殖红鳍东方()中分离的细菌进行了主要生物学特性研究.主要包括形态特征、理化特性等较系统的表观分类学指征鉴定;同时对代表菌株进行了16S rRNA基因的分子鉴定,测定了16S rRNA基因序列、分析了相关细菌相应序列的同源性、构建了系统发生树;结果表明,分离菌为弧茵属(Vibrio Pacini 1954)的杀对虾弧菌(Vibrio penaeicidasp.nov.Ishimaru et al 1995).代表菌株(Hc051105-6株)16s rRNA基因序列长度(不包括引物结合区)为1443bp(GenBank登录号:EU073023),代表菌株(HC051105-8株)16S rRNA基因序列长度(不包括 引物结合区)为1450bp(GenBank登录号:Eu073024).择代表菌株做对健康红鳍东方鲀的人工感染试验,认为分离鉴定的杀对虾弧菌在被检红鳍东方鱼电病例具有一定的病原学意义.药敏试验结果显示,对供试37种抗菌药物中,在一些药物中存在耐药性的菌株间差异.     

应用免疫荧光技术对三种赤潮藻的研究

为探索和建立免疫学结合荧光技术对赤潮生物的定性、定量检测,制备了3种粒径不同的赤潮藻——赤潮异弯藻(Heterosigma akashiwo)、共生甲藻(Symbiodinium sp)、链状亚历山大藻(Alexandrium catenella)的多克隆抗体,并采用封闭吸附处理以提高抗体的特异性;采用间接酶联免疫法检测了抗体的效价;结果表明未经吸附处理的赤潮异弯藻、共生甲藻的效价分别为1:41 000,1:18 000以上,显示是高亲合力的抗体;链状亚历山大藻抗体的效价达到1:3 500,相比另两种藻的效价较低;吸附处理后的3种多克隆抗体的特异性明显提高,而效价有所下降。3种多克隆抗体与各自藻细胞均有很强的结合力,赤潮异弯藻和共生甲藻的荧光信号均匀分布于细胞表面,链状亚历山大藻细胞的荧光信号在细胞表面分布不均匀,主要集中在腹部横沟内。制备的多克隆抗体只与自身藻细胞结合,与另外2种藻细胞无交叉反应。链状亚历山大藻抗体只与自身藻细胞结合,与塔马亚历山大藻无交叉反应,可作为同属内不同种的鉴别。结合了免疫学和荧光技术,具有特异、灵敏、直观和简便的优点,并且费用低,对于开拓赤潮准确定性、定量检测方法和技术具有重要价值。     

斑节对虾TSG101基因的克隆及表达分析

为探究肿瘤易感基因101(简称TSG101)对斑节对虾(Penaeusmonodon)的免疫应答作用,了解在细菌刺激下斑节对虾的机体发生的变化机制,本研究以哈维弧菌(Vibrioharveyi)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)为实验组,以磷酸缓冲液(PBS)为对照组,通过荧光定量分析展开对斑节对虾对菌刺激的免疫应答作用。结果显示,斑节对虾的TSG101在各组织中均有表达,在肝胰腺中的表达量最高。在金黄色葡萄球菌刺激下,斑节对虾的TSG101在肝胰腺中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第12小时的TSG101 mRNA的表达量达到最大(为对照组的21.60倍);在鳃中的表达量与对照组相比呈极显著上调(P0.01),第6小时斑节对虾TSG101的表达量达到最大值(为对照组的3.64倍)。在注射哈维弧菌第9小时,肝胰腺中的PmTSG101 mRNA表达量极显著上调(P0.01)且达到最大(为对照组的2.50倍)。实验结果初步表明,斑节TSG101参与斑节对虾的先天免疫反应,在金黄色葡萄球菌和哈维弧菌的刺激的情况下,该基因RNA水平的表达情况发生明显变化。     

利用扩增vvhA基因的环介导等温扩增技术快速，特异而敏感地检测创伤弧菌

创伤弧菌是一种可感染人类的河口病原菌。建立快速,特异而敏感的检测方法,有助于创伤弧菌感染的早期疾病诊断和及时治疗。本研究设计了针对vvhA基因的一系列引物（包括两对外部引物和两对内部引物）,采用环介导等温扩增技术（LAMP）来检测创伤弧菌。结果显示,本方法的最适扩增温度是63℃,反应仅需35分钟。扩增产物不仅可以用含有DNA ladder的琼脂糖凝胶电泳检出,也可借助钙黄绿素直接肉眼观察。采用45株菌株检测该方法的特异性,其中所有创伤弧菌均被检出而其他菌株检测结果皆为阴性。本方法的敏感性是普通PCR扩增的100倍,同时利用该方法可以准确检测出所有的模拟样品、临床标本及环境样品。与其他已知方法比较,针对vvhA基因的介导等温扩增技术可以快速、简单、敏感及特异地鉴定创伤弧菌。     

一株副溶血弧菌噬菌体VPp1 的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法,从水产品市场处污水中分离出一株副溶血弧菌噬菌体 VPp1.并借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,同时测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线以研究其裂解性能.分类鉴定结果表明,其核酸是线型双链DNA,大小在15 kb 左右.具有一个正二十面体的头部,头部直径大约为44 nm,无尾,属盖噬菌体科(Tectivirus);裂解性能研究结果表明,其在双层平板上培养12 h 可形成中心清亮的噬菌斑,周围有大而明显的晕环.最佳感染复数为0.0001,潜伏期为10 min,裂解量为90.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体,可用作进一步的应用.     

三疣梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病性研究

为进一步搞清养殖梭子蟹肌肉乳化病的病原及其致病机理,找到有效的防治方法,2002-2004年在浙江省宁波、舟山等地养殖场,从濒死的梭子蟹体内分离出1205-11和1205-21两株菌。通过菌体形态、培养特性和生理生化反应,鉴定这2株菌分别为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和葡萄牙假丝酵母(Candida lusitaniae)。人工感染试验证实,这2株菌是梭子蟹肌肉乳化病的病原菌,葡萄牙假丝酵母为继发性感染病原,蟹体外部的损伤及蟹之间相互残伤可能是传染的主要途径。     

响应面法优化南极菌Psychrobacter sp.B-3的发酵产糖条件

为对南极菌Psychrobacter sp.B-3产胞外糖的发酵条件进行优化,以温度、pH、不同碳源、不同氮源、不同金属离子及海水配比作为唯一变量进行单因素实验,筛选出对产糖有显著影响的单因素取值范围;在此基础上,利用Plackett-Burman实验设计筛选出影响产多糖的3个主要因素,即酵母粉、陈海水配比和装液量.然后通过Box-Behnken实验设计及响应面分析法进行回归分析,得出了南极菌Psychrobacter sp.B-3发酵条件系统优化的结果为:酵母粉1.1 g/L,陈海水与自来水的配比为2:1,装液量为50％,蛋白胨6.0 g/L,接种量1.5％,培养时间64 h,BaCl20.03 g/L,温度10℃,转速150 r/min,pH为7.0.优化后发酵液中的糖含量由优化前的444 μg/mL提高到624 μg/mL,相比初始糖产量提高了40％.结果表明,响应面法可显著优化南极菌Psychrobacter sp.B-3液体发酵产胞外糖的条件.     

中国南海一株固氮类芽孢杆菌的筛选和分离鉴定

为了解中国南海海洋自生固氮菌的种类,作者对采集的南海海底淤泥样品进行了固氮微生物的分离、筛选及鉴定。经过土样沸水加热处理,无氮培养基平板初筛后,对分离获得的细菌固氮酶结构基因nif H进行扩增,并对其固氮酶活性进行检测,最终获得一株能够产芽孢的固氮细菌。对该菌株进行生理生化性状测定、16S r DNA序列分析(Gen Bank登录号KJ627376),并基于nif H、16S r DNA系统进化树分析,确定该菌为一株固氮类芽孢菌(Paenibacillus sp.)NH-1。本研究表明固氮类芽孢杆菌在海洋中确有分布,海洋自生固氮菌的多样性远远超出人们之前的认识。     

盐田嗜盐单胞杆菌的分离鉴定及其PHB 积累的研究

微生物聚合物聚-?-羟基丁酸酯(PHB)具有良好的生物降解性、生物相容性和热塑性,在环保、医药和农业领域具有广阔的应用前景。高PHB积累菌株的获得及其发酵条件的研究具有很好的实用价值。作者从渤海湾日晒盐场盐田卤水中分离出一株杆状细菌,经16S r DNA序列测序比对,确定为盐杆菌属(Halomonas),命名为Halomonas 100-16-2,其最适生长盐度为50~100,最适生长p H为7~8,属中度嗜盐菌。在酸水解酪蛋白(7.5 g/L)的基础培养基中分别添加0、10、20和30 g/L葡萄糖,研究盐度100条件下不同葡萄糖添加量对Halomonas 100-16-2生长和PHB含量的影响。结果表明,随着葡萄糖浓度的增加,该菌株的生长和PHB积累显著提高。葡萄糖质量浓度为30 g/L时,细胞干质量达8.60 g/L,PHB含量达到5.57 g/L(即达到细胞干质量的65%)。本研究为渤海湾盐田微生物资源的开发和利用提供了有价值的基础数据。