溶藻弧菌的间接荧光抗体快速检测

建立了大黄鱼病原溶藻弧菌的间接荧光抗体检测方法，溶藻弧菌的特异性抗血清由新西兰兔制备，试管凝集法测定抗血清及交叉反应效价，吸附离心法去除交叉反应，荧光抗体为异硫氰酸荧光素标记的羊抗兔免疫球蛋白，现场检测对具典型弧菌病表症大黄鱼病原检出率为100％，表观健康大黄鱼病原检出率为30％，养殖海水检测结果均为阴性，结果表明，间接荧光抗体检测法不仅可以用于已感染发病大黄鱼的快速检测，而且还能用于已感染未发病大黄鱼的检测。     

中国对虾复合疫苗的初步研究

于１９９６年１１月－１９９７年５月,运用差异离心,蔗糖梯度离心、柱层析等方法从发病中国对虾分离出杆状病毒并纯化;分别用冷乙酸处理法、十二烷基硫酸钠－苯酚法提取纯化该病毒的结构蛋白与核酸、λＤＮＡ;分别用十二烷基硫酸钠煮沸法、三氯乙酸法纯化孤菌的肽菊聚糖和鸡卵粘蛋白;配制出小牛血清白蛋白、蜗牛凝集素两溶液。然后从超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）活力和溶菌活力两种免疫指标分析灭活病毒和以上提取、纯化的７种大分     

养殖牙鲆鳗弧菌疫苗的研究

以牙鲆病原性鳗弧菌M3为抗原,制备了细胞（CV）、细胞－胞外产物（CEV）、脂多糖（LPS）三种疫苗,通过浸泡和注射两种途径对牙鲆进行两次免疫,检测疫苗的免疫保护效果。免疫后4周可检测到免疫组牙鲆具有明显的凝集抗体效价,其中注射组效价显著高于浸泡组,而对照组变化不明显。与对照组相比,免疫组牙鲆获得良好的免疫保护力,其中注射免疫组高于浸泡组。在注射免疫途径中,以CEV的免疫保护效果最好;在浸泡免疫途径中,以CEV和LPS的免疫保护效果最好。结果表明鳗弧菌M3的细胞－胞外产物苗有显著的免疫保护作用。     

皱纹盘鲍脓疱病病原菌──河流弧菌-Ⅱ的抗药机制的初步研究

1993年9月至1995年末，大连地区的一龄鲍至成鲍都出现了脓疱病，用常规方法从3个养殖厂的病鲍中分离到了3个菌株，分别为D株、N株和T株。经鉴定这3个菌株为同一种──河流弧菌-Ⅱ。这3个菌株来自3个不同的海区、不同的单位，并且这3个单位使用的抗生素种类和浓度也木同，所以这3个菌株对18种抗生素的敏感度也木同。D株对环丙沙星（抑菌坏直径30mm）、复方新诺明（抑菌坏直径27mm）等敏感，而对青霉素、青霉素Ⅱ、氨苄青霉素（抑菌环直径0mm）等耐药。N株除对青霉素Ⅱ、白霉素、吡哌酸等耐药外，对其它12种抗生素都敏感或中度敏感（抑菌环直径13．5－30mm）。T株对氟派酸（抑菌环直径22mm）、环丙沙星（抑菌环直径20．3mm）等敏感，而对氯霉素、复方新诺明等耐药。研究发现，经常使用同一种抗生素很容易使病原菌产生耐药性．连续3d使用单一的抗生素（青霉素）就会产生耐药的菌株。为证明上述3个菌株的抗药性是属于哪一类，以T株为例，提取总DNA，并对总DNA进行EcoRⅠ酶切图谱分析，图谱有明显的异同，说明3个菌株的抗药性不同可能与基因突变有关。不管是非遗传型还是遗传型，都是由于抗生素为细菌提供了耐药突变株的选择环境，从而使耐药菌株得以大量繁殖。     

泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)病原霍乱弧菌(Vibrio cholerae)PCR 与LAMP检测方法的比较研究

采用分子生物学方法,以霍乱弧菌lolB为靶基因设计特异性引物,进行了霍乱弧菌的PCR和环介导等温核酸扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测技术研究,并对它们的特异性、灵敏性和实际应用进行了比较.结果表明,所建立的PCR检测霍乱弧菌的方法最低检测限为4.0× 103 CFU/ml; LAMP检测方法在65℃下恒温扩增60min,检测限为4.0×101 CFU/ml,反应产物加入荧光染料SYBR Green Ⅰ后反应液呈现明显的绿色;以温和气单胞菌、副溶血弧菌、鳗弧菌及美人鱼弧菌为对照菌株,检测结果均为阴性;霍乱弧菌人工染菌的8种水产品进行PCR及LAMP检测,结果均为阳性,而未染菌组均为阴性;PCR及LAMP检测霍乱弧菌的方法均具有灵敏度较高、特异性强等优点,且LAMP检测霍乱弧菌的方法灵敏度是PCR方法的100倍,更适合于养殖现场检测的推广使用.     

3种水产病原弧菌(Vibrio)的16S—23S rDNA间区(IGSs)的克隆、测序与分析

根据细菌16S rDNA3端和23S rDNA5端的高度保守区设计引物,PCR扩增了5株溶藻弧菌、2株河流弧菌和2株创伤弧菌的16S—23S rDNA间区,克隆到pGEM-T载体上,测序;采用BLAST和DNAstar软件对16S—23S rDNA间区序列及其内的tRNA基因进行比较分析研究。结果表明,3种弧菌共测出的16S—23S rDNA间区有33条,类型有6种:IGSGLAV、IGSGLV、IGSIA、IGSG、IGSA和IGS0,其中IGSIA和IGSG最为常见,9株弧菌均包含有此两类IGS;在3种弧菌中,大部分IGS序列tRNA基因两端的非编码区具有较高的种内同源性,可以成为设计种特异性引物和探针的靶区。16S—23S rDNA间区结构的差异为建立一类新的弧菌检测方法奠定了基础。溶藻弧菌的16S—23S rDNA间区序列为首次报道。     

鳗弧菌对魁蚶血细胞形态及免疫功能的影响

本研究采用快速瑞氏-吉姆萨染色法观察鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激后魁蚶(Scapharca broughtonii)几种血细胞的形态变化,研究不同种类血细胞的免疫功能。魁蚶血淋巴液中红细胞、白细胞和血栓细胞经免疫刺激后均发生形态改变,属于免疫防御的应激反应。经鳗弧菌免疫刺激后,红细胞无丝分裂现象增多,并参与病原菌的吞噬作用;白细胞变形运动、吞噬和融合现象普遍,细胞表面具有粘性,参与血栓的形成;血栓细胞主要表现出粘连和凝血的特性,偶有吞噬病原菌的现象;研究中检测了2种常规抗凝剂的抗凝效果,结果表明,2种抗凝剂分别改变了血栓细胞和白细胞的表面粘连特性,从而阻止它们参与凝血,因而都具有抗凝效果。本研究结果表明,魁蚶血细胞分工明确,能共同防御病原菌的入侵,细胞免疫在魁蚶血淋巴液抗菌免疫中起极其重要的作用,血细胞的形态变化和免疫功能分析可为后期研究魁蚶抗菌机制和筛选抗凝剂奠定基础。     

一株副溶血弧菌D3112致病性和抗药性的表征

副溶血弧菌广泛分布于海洋环境中,虽然大多数环境菌株并非致病菌,但它们常常携有毒力基因,从而具有潜在的致病性。本文从黄海(山东青岛)海水中分离到一株副溶血弧菌D3112,对其进行了全基因组测序、溶血实验和人工感染实验等。基因组测序分析发现D3112并不含有副溶血弧菌的致病性标志溶血素基因tdh和trh,这与PCR检测结果一致,但含有其他溶血素基因以及多种毒力相关基因。生物学实验显示,该菌可产生明显的溶血现象,而且具有蛋白酶、明胶酶、脂酶和淀粉酶活性,但是缺少卵磷脂酶活性。人工感染实验表明副溶血弧菌D3112具有致病性,感染斑马鱼的半致死剂量约为5×105CFU。药物敏感实验证明了D3112具有多重耐药性。本文对海洋环境中的副溶血弧菌D3112同时开展了基因型和表型研究,为准确评价环境细菌的潜在致病性提供了有用的数据信息。     

皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究

于１９９３－１９９５年，用免疫法防治皱纹盘鲍脓疱病，河流弧菌－ＩＩ分离自大连水产养殖公司，太平洋海珍品养殖公司的患脓疱病的皱纹盘鲍；健康皱纹盘鲍，由大连水产养殖公司石庙苗种厂提供，鲍血淋巴细胞的体外培养吞噬实验，取健康皱纹盘鲍的血淋巴与肝素和菌液铵一定比例混合后，置湿盒内３７℃培养３０ｍｉｎ，取一滴涂片，吕氏液染色后观察，用该病原菌制做菌苗，大量扩增病原菌，用０．１％－１．０％的甲醛洗下菌苔，处理     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。