A culture-free method for detection of Vibrio vulnificus from coastal seawater based on loop-mediated isothermal amplification targeting vcgC gene

Vibrio vulnificus is an opportunistic pathogen widely distributed in estuarine and coastal seawaters. In this study, a culture-free method was developed to rapid detection of V. vulnificus in all seasons, based on loop-mediated isothermal amplification (LAMP) targeting virulent-correlated gene (vcg). The new assay method allows differentiation between the virulent and non-virulent strain of V. vulnificus accurately. This method also allows effective detection of the pathogeny in winter when the bacterium lives in the viable but non-culturable (VBNC) state. A total of 30 costal seawater samples collected in all seasons were used for the evaluation of this method. The results show that the method is sensitive, accurate and convenient.     

Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控分析

为探讨分子伴侣Hfq对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)毒力的调控作用,本文分析了溶藻弧菌ZJ-T野生株、hfq突变株及回补株各项与毒力相关的生理生化指标。研究结果显示:在半固体和固体LBS平板中,缺失株游动和涌动能力显著降低(P0.001);hfq缺失株生物膜合成速度及合成量降低,但解离速度增加;在限铁环境下,缺失株生长有所减弱;缺失株胞外蛋白酶分泌增强(P0.01);同野生株和突变株相比,缺失株对小鼠成肌细胞系C2C12细胞几乎不致死,且其对石斑鱼的半数致死量提高3个数量级。实验结果表明:Hfq对溶藻弧菌毒力具有重要调控作用,并通过调控其运动、生物膜形成、铁代谢、胞外蛋白酶分泌等生理生化过程从而调控其毒力。本研究可为溶藻弧菌病害暴发的防治提供重要理论依据。     

Rearing in intermediate salinity enhances immunity and disease-resistance of turbot (Scophthalmus maximus L.)

Studies were conducted to investigate the non-specific immune responses and disease-resistance of juvenile turbot Scophthalmus maximus,cultured at four different salinities(8,20,32 and 40) . Three concentrations(3.75 × 10 7,3.75 × 10 8 and 3.75 × 10 9 CFU/ml) of Vibrio anguillarum suspension were employed at each salinity to determine the 4-day LD 50 . The serum lysozyme activity,the alternative complement pathway activity(ACH50) and the phagocytosis percentage of head kidney in turbot were tested at 24,48 and 72 h post-challenge of V. anguillarum(1.1 × 10 8 CFU/ml,0.1 ml) ,respectively,to evaluate the non-specific immune responses at the selected rearing salinities. Fish reared at salinity 20 had the lowest mortality,namely,the highest 4-day LD 50 value(8.88 ± 0.17) . Besides,the lysozyme activity,ACH50 and the phagocytosis of turbot were the highest at the salinity 20,but with the lowest at the salinity 40 treatment regardless of sampling time. In addition,the non-specific immune activities kept increasing within 72 h post-challenge of V. anguillarum,except that the lysozyme activity increased from 24 to 48 h,and then decreased from 48 to 72 h at 40 significantly. These results together indicate that rearing in intermediate salinity(20) was able to enhance the immunity and disease-resistance of turbot.     

感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾不同组织的Toll样受体基因表达变化研究

为研究不同类型Toll样受体基因在凡纳滨对虾免疫调控机制中的作用,实验首先通过荧光定量PCR方法检测了凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同组织中的表达情况。结果表明凡纳滨对虾3种Toll样受体基因m RNA在各组织中均有表达。其中,Toll1基因在肌肉,血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,心脏表达量最高;Toll2基因在血淋巴,心脏和鳃均有较高表达,其中在鳃表达量最高;Toll3基因在鳃和心脏有较高表达,其中在鳃表达量最高。实验还对人工感染溶藻弧菌及白斑综合症病毒后凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在不同免疫组织的表达变化差异进行研究。感染白斑综合症病毒后凡纳滨对虾血淋巴及鳃中3种Toll样受体基因表达量均显著提高,并在各自达到表达峰值后逐渐下降直至恢复到感染前水平。感染溶藻弧菌后凡纳滨对虾血淋巴中3种Toll样受体基因表达量均显著提高;鳃中Toll1及Toll3表达量分别于感染后3h和12h有显著提高,而Toll2表达量无显著提高。由此推测3种Toll样受体基因均可能参与白斑综合症病毒感染所引起的免疫调控;而在溶藻弧菌感染所引起的免疫调控中,除了Toll1,Toll3参与鳃的免疫调控外,Toll2基因还参与血淋巴中的先天性免疫调控。长期感染白斑综合症病毒或溶藻弧菌后,凡纳滨对虾3种Toll样受体基因在血淋巴与鳃中的表达量均显著升高,这可能与虾体在长期感染过程中,需要不断保持较高免疫水平有关。     

非可培养状态哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)复苏后生理特征及毒力相关基因表达

将哈维氏弧菌SF1接种在自然海水中低温诱导进入活的非可培养状态,用添加营养物质后升温培养的方法进行复苏。用透射电镜观察不同状态哈维氏弧菌细胞形态和结构,研究哈维氏弧菌复苏后对不良环境的抵抗力,用RT-PCR检测丝氨酸蛋白酶基因Ser和rpoS基因的表达。结果表明,进入VBNC状态的哈维氏弧菌由杆状变为球状,体积比正常细胞小,复苏后恢复正常形态且对紫外辐射,热激的抵抗能力没有明显改变,对高渗透压的抵抗力减弱,而对冷激的抵抗力增强。复苏后的哈维氏弧菌对抗生素的敏感性没有改变。用RT-PCR未检测到在VBNC状态时Ser和rpoS基因的表达,而在复苏后的细胞均检测到该基因的表达,可能是其保持致病性的重要原因之一。     

聚合酶链反应(PCR)检测花鲈鳗弧菌感染

从海洋鱼类重要病原菌———鳗弧菌基因库中选择金属蛋白酶基因为目标检测基因 ,以此设计一对引物 ,建立聚合酶链反应 (PCR)检测鳗弧菌的方法 ,并对此方法的灵敏性和特异性进行了研究 ,结果表明该方法对鳗弧菌的检测快速、灵敏。对人工感染鳗弧菌的花鲈组织样品进行检测 ,该方法能识别组织样品中极微量的鳗弧菌。     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)感染后牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清抗菌物质的研究

采用1×107cells/ml的河流弧菌悬液背部肌肉注射感染牙鲆,注射后24h、48h试验组的血清抗菌活力分别极显著性(P0.01)和显著性(P0.05)高于对照组。用Sephadex G-25凝胶柱对第二次人工注射感染后24h牙鲆血清进行分离,其中第7—15收集管对河流弧菌具有抗菌活性,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等指示菌也具有明显的抗菌作用,在4—100℃范围内,大部分活性分离组分随着温度的升高其抗菌活力有所增强。具有抗河流弧菌活性收集管(第9管)经弱阳离子交换柱分离后,OD280显示出2个蛋白吸收峰,具有抗河流弧菌活性的物质主要集中在第1吸收峰。SDS-PAGE分析显示经Sephadex G-25凝胶柱和弱阳离子交换柱分离的抗菌蛋白分子量较大。以上结果表明,牙鲆被河流弧菌感染后能很快产生大量抗菌物质释放到血清中;主要抗菌物质的分子量较大,且热稳定性较好;这些活性物质的抗菌活性具有较强的特异性。     

仿刺参体腔细胞原代培养以及灿烂弧菌胞外产物对其毒性的研究

采用CCM、HSM和L-15N 3种培养液对刺参(Apostichopus japonicas)的体腔细胞进行了体外原代培养,并用MTT还原法对细胞的体外存活力进行测定,结果显示:CCM和HSM培养的体腔细胞,在体外分别存活至3 d和6 d大量死亡;L-15N培养液可使细胞在1周内保持存活.用刺参病原菌灿烂弧菌的胞外产物与刺参体外培养细胞共培育,发现对体腔细胞有毒性作用,半致死蛋白质浓度(IC_(50))为27.6 μg/mL.     

哈维弧菌和鲍类疱疹病毒刺激对杂色鲍免疫相关因子的影响

以哈维弧菌(Vibrio harveyi)、鲍类疱疹病毒(Abalone herpesvirus,Ab HV)悬液对杂色鲍(Haliotis diversicolor)注射刺激,研究其血淋巴中可溶性总蛋白浓度,免疫相关酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)活性的变化,杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺、腹足中血蓝蛋白(Hemocyanin,Hc)基因Hc1、Hc2相对表达量的变化以及感染后杂色鲍无细胞血浆的抑菌性。结果显示:(1)杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度变化显著,呈现出先升高后降低的趋势。(2)无细胞血浆中的SOD、ACP、AKP活性与对照组相比变化显著,哈维弧菌注射组的SOD活性在感染后第6小时显著升高;Ab HV注射组SOD活性与对照组比较在注射后的各个时相均呈下降趋势,从注射后6 h各个时相的SOD活性与对照组相比均差异显著(P0.05)。哈维弧菌注射组ACP活性在注射后的第48小时显著升高;Ab HV注射组ACP活性在注射后的第12小时显著升高。哈维弧菌注射组AKP活性在注射后48 h显著升高;AbHV注射组AKP活性在注射后第12小时显著升高。(3)杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺以及腹足中血蓝蛋白两个基因Hc1、Hc2的相对表达量均在注射后的不同时间点出现升高。(4)杂色鲍无细胞血淋巴对哈维弧菌、创伤弧菌和溶珊瑚弧菌这三种贝类病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明细菌和病毒的刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。本研究为今后进一步研究杂色鲍的非特异性免疫以及在生产实践中应用免疫技术防治病害提供参考。     

基于16S rDNA和看家基因序列分析技术的鲍鱼养殖水体弧菌种类的鉴定

采用TCBS选择性培养基从厦门某鲍鱼养殖场的养殖水体中分离到19株细菌.经16S rDNA序列分析,所有菌株均属于弧菌属（Vibrio）,且与最近似的弧菌模式种的同源性都在98.99%以上.由于弧菌种间16S rDNA序列相似度极高,无法仅靠16S rDNA序列比对来鉴定这些菌株到种的水平.16S rDNA序列的系统发育分析也显示,大多数菌株与弧菌模式种无法归为一簇,表明16S rDNA基因在弧菌种的分类鉴定上分辨率不高.进一步采用基于4种看家基因（rpo A、pyr H、gap A和top A）的多位点序列分析技术（MLSA）对分离到的弧菌菌株进行分类鉴定,结果显示19株海洋弧菌归于溶藻弧菌（Vibrio alginalyticus）与魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）2个种,表明这两种弧菌是该鲍鱼养殖场水体环境中的优势弧菌种,在鲍鱼养殖弧菌病害防治方面需要重点关注.此外,看家基因与16S rDNA基因的多态性分析表明,4种看家基因的多态位点比率均高于16S rDNA.4种看家基因串联后的多态位点比率高达41.1%,远高于16S r DNA基因的13.4%,表明看家基因相较于16S rDNA基因有着更高的分辨率,更适合于海洋弧菌的分类鉴定.