Impact of external factors on sperm motility of Sepiella maindroni

Sperm motility is important in reproductive biology. To understand the physiological ecology characteristics of sperm of Sepiella maindroni, we studied the activation rate, active time, and lifespan of sperm to evaluate the influence of external factors, including temperature, salinity, pH, glucose, NaCl, KCl, MgCl2, CaCl2, EDTA-2Na and artificial seawater on sperm motility. The results show that the appropriate activation and motility condition for sperm were: temperature 20?30°C (optimum 25°C), salinity 10.6?30.6 (optimum 15.9) and pH 8.0?8.6 (optimum 8.0-8.4). Sperm activity varied in different concentrations of glucose, NaCl, KCl, MgCl2 and CaCl2. None of the selected concentrations of EDTA-2Na solution could activate the sperm. The activation rate in artificial seawater devoid of Ca2+, Mg2+ or HCO3ˉ was low. The results should help further studies on the preservation and activation of squid sperm.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型谷胱甘肽硫转移酶基因的克隆及重组表达

采用EST结合RACE技术进行了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)sigma-型GST(SmGST)基因的克隆。结果表明,该基因的cDNA全长为838bp,其中5′非编码区为73bp,3′非编码区为150bp,开放阅读框为615bp,编码的蛋白含有204个氨基酸。该基因的氨基酸序列中包含1个典型的GST-N结构域和一个GST-C结构域,与栉孔扇贝和长牡蛎的sigma-型GST的相似度分别为40.3%和39.3%。将该基因的编码区重组到pET-21(a+)载体后在大肠杆菌中得到诱导表达。重组SmGST的GST活力为(12.22±0.92)U/mg蛋白。     

Isolation via enrichment and characterization of ten polymorphic microsatellite loci in the cuttlefish, Sepiella maindroni de Rochebruns

Ten novel polymorphic microsatellite loci were developed using an enrichment and colony hybridization protocol and characterized for the cuttlefish, Sepiella maindroni. Polymorphism was explored by using 30 individuals from the coastal waters of Zhanjiang, Guangdong province, China, in December 2007. The number of alleles ranged from 5 to 13. The ranges of observed and expected heterozygosity were from 0.578 9 to 1.000 0 and 0.682 8 to 0.925 7, respectively, and the average polymorphic information content (PIC) was 0.778 5. These microsatellite loci will certainly facilitate the detection of the genetic variation and population structure of S. maindroni.     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)繁殖习性及其产卵场修复的研究

采用对比分析方法,观察了曼氏无针乌贼的繁殖习性,比较了不同产卵附着物的附卵效果,选择典型产卵场(中街山列岛海区)进行附着物的调查。结果表明,曼氏无针乌贼有较高等复杂的性行为,有显著的求偶、争偶及雌雄搏斗现象,乌贼交配对其它乌贼交配有诱导作用;乌贼对附卵基有严格选择,没有充足适宜的附卵基,不仅使乌贼产卵时间延迟、数量减少,而且易被水流冲散、沉入底部致受精卵大量死亡,是影响乌贼繁衍的重要因素;附卵基附卵效果依次为聚乙烯(PE)绳、聚丙烯(PP)绳、钢筋、竹子、木头,颜色依次为黑色、蓝色、红色、黄色,形状依次为圆柱体、正三棱柱体、正长方体、扁长方体,粗度以直径0.25—0.50cm为宜,此外附卵基间应有适当空隙;目前,中街山列岛海区柳珊瑚(Plexaauraa sp.)生物量为0.15—0.64棵/m2,平均生物量为0.32棵/m2,资源数量趋于恢复,但远不能适应乌贼资源修复需要。增殖放流试验表明,修复乌贼资源的可能性很大,但在加大增殖放流工作的同时,必须尽快开展产卵场生态环境修复尤其是产卵附着物修复工作。     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)精子形成的超微结构

采用透射电镜技术,研究了曼氏无针乌贼精子形成的超微结构变化.结果表明,曼氏无针乌贼精细胞形成初期,细胞核圆形,染色质小团块状,线粒体、高尔基体、中心粒等细胞器分散在细胞质中.随后精细胞形态发生了一系列变化:(1)核内染色质凝集经颗粒化、细纤维化及粗纤维化,最终形成高电子密度的均质结构;(2)核形由圆形或椭圆形,变成长椭圆形,再拉长成长柱状纺锤形,核后端侧部内陷形成核后窝,"9 2"轴丝结构由此形成;(3)高尔基囊泡积累电子致密物,融合发育成顶体囊,并逐渐演变成n形顶体;(4)线粒体逐渐向核后端移动,形成精子尾部中段的线粒体spur.     

曼氏无针乌贼(Sepiella japonica)促性腺激素释放激素(GnRH)基因的鉴定、特征及成熟期的表达研究

促性腺激素释放激素（GnRH）在脊椎动物的繁殖过程中起着至关重要的作用,同时也存在于许多无脊椎动物中。利用cDNA末端快速扩增技术（RACE）克隆出曼氏无针乌贼（Sepiella japonica）促性腺激素释放激素（命名为SjGnRH,KP 982885.1）。SjGnRH基因的cDNA全长710 bp,开放阅读框（ORF）为273 bp,编码90个氨基酸,包括一条含有31个氨基酸的信号肽、12个氨基酸的GnRH多肽和44个氨基酸的GnRH相关肽（GAP）;SjGnRH与剑尖枪乌贼（Uroteuthis edulis）和真蛸（Octopus vulgaris）的同源性分别为86.7%和73.3%;SjGnRH高度保守的十二肽与剑尖枪乌贼和真蛸的octGnRH相似度达100%,其信号肽的相似性分别为66.7%和54.8%,GAP区的相似性分别为95.5%和77.3%;实时荧光定量PCR（qRT-PCR）结果显示,SjGnRH基因在成熟期的表达具有特异性,在脑中表达量最高,且与其他组织差异显著（P<0.05）;采用原位杂交技术检测SjGnRH mRNA在脑内的表达模式,结果表明：SjGnRH在食道上神经团、食道下神经团和视叶的不同部位均有表达,暗示SjGnRH可能参与曼氏无针乌贼的生殖调控作用。     

曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库的构建和表达序列标签分析

以曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）肌肉组织为研究材料,利用Clontech公司的cDNA文库构建试剂盒构建了曼氏无针乌贼肌肉cDNA文库．对文库质量的分析结果表明：cDNA文库的库容量约为1．2×10。克隆（cfu／dm^3）,重组率达96％,插入片段平均长度大于l000bp．挑取568个阳性克隆进行5’末端测序,其中475条ESTs长度大于100bp,初步拼接后得到200个单基因簇,包括41个重叠群和159个单拷贝EST,冗余度为57．89％．经检索,53条ESTs（占比为26．5％）在BLASTx上无明显的同源性（E值≥1．00×10^-10）,为新基因．147条ESTs（占比为73．5％）与已报道的基因有较高的同源性;其中与能量相关基因的ESTs丰度最高,占总数的23．0％．细胞信号传导、细胞骨架和蛋白质代谢的次之,比例分别为17．5％、12．5％、9．5％,其中包括热激蛋白70、转铁蛋白等．这些EST数据有助于进一步筛选和克隆曼氏无针乌贼和其他头足动物的肌肉特异性表达基因．     

曼氏无针乌贼（Sepiellamaindroni）ISSR体系优化及养殖群体遗传多样性分析

采用ISSR-PCR技术对曼氏无针乌贼基因组DNA进行扩增,筛选分析了ISSR—PCR扩增时的主要影响因子,包括Mg^2＋浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度以及退火温度,并用8条ISSR引物对舟山养殖群体进行了遗传多样性分析,最终确立的适用于曼氏无针乌贼ISSR扩增的25μl反应体系为：Mg2＋1．5mmol...     

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)SCD基因全长cDNA的克隆和序列分析

硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)是脂肪代谢的关键酶。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆了曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)SCDcDNA的全序列,序列全长1513bp,由261bp的5′非翻译区、编码306个氨基酸的921bp开放阅读框和331bp的3′非翻译区组成。在线翻译所得多肽理论分子量为34.92kDa,等电点为8.95,是疏水性蛋白,含有丰富的螺旋结构(45.10%),存在4个跨膜区。其氨基酸序列与真蛸(Octopus vulgaris)和长牡蛎(Crassostrea gigas)相似性达到91%,与其它非软体动物也表现为50%以上的相似性,说明SCD结构相对保守;系统进化树结果表明曼氏无针乌贼和真蛸及牡蛎进化关系最近,与鱼类稍远,与人及大鼠等哺乳动物亲缘关系最远。SCD基因是改善曼氏无针乌贼肉质的重要候选基因,其成功克隆及相关分析对于深入探讨软体动物脂肪酸代谢相关基因在生物体内作用机制及调控机理具有重要意义。     

4种常见头足类动物的血细胞分类及比较

以长蛸(Octopus variabilis)、短蛸(Octopus ocellatus)、真蛸(Octopus vulgaris)和曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)的血细胞为研究对象,通过光镜和电镜观察对血液中的血细胞形态结构进行比较。根据观察结果,将头足类血细胞分成3种类型:透明细胞,小颗粒细胞和颗粒细胞,但在真蛸血细胞中有一定数量的血细胞其细胞核呈马蹄形,因此将此类细胞独立划为马蹄形核细胞。通过比较发现,曼氏无针乌贼的血细胞与其它3个种存在明显的差异,其胞质内的颗粒数量与性质均与其它3个种有较明显的区别差异。从总体来看,头足类血细胞内含颗粒数量较少,其颗粒的数量与免疫力的强弱无直接关联。通过对比,推断真蛸血细胞中的马蹄形核细胞为透明细胞到小颗粒细胞的中间类型,从而得出此4个类型细胞有从透明细胞→马蹄形核细胞→小颗粒细胞→颗粒细胞的发育进程。