岱衢洋大黄鱼(Pseudosciaena crocea)胚胎与仔稚幼鱼发育

对养殖岱衢洋大黄鱼进行人工催产、自然产卵获得受精卵,在人工培育条件下观察了其胚胎及仔稚幼鱼发育过程。结果表明:1)岱衢洋大黄鱼受精卵呈圆球形,浮性;2)在水温23.0~24.0℃、盐度22.1条件下胚胎发育历时25.5h,主要经历了卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期及孵化期等阶段;3)在水温22.0~24.0℃、盐度22.1~23.4条件下,仔鱼发育经历了前期仔鱼(0~7日龄)和后期仔鱼(8~18日龄);4)19日龄进入稚鱼前期,各鳍齐全;5)29日龄进入稚鱼后期,鳞片出现;6)36日龄以后全身被鳞,进入幼鱼期。仔稚幼鱼生长方程为TL=0.570 3 D+0.750 1(R2=0.965 8),全长和日龄呈极显著线性相关。     

Germplasm of breeding Pseudosciaena crocea as revealed by microsatellite markers

The germplasm of breeding large yellow croaker （Pseudosciaena crocea Richardson） was revealed using 12 microsatellite markers. The results showed that the genetic diversities were on a mediated level in the bred Daiqu and Min - Yue stocks and two hybrid groups, as represented by 4.83 of the mean number of alleles and 0.561 of the average observed heterozygosity. The value of pair- wise differentiation coefficient（ FST ） was only 13. 1% between Daiqu and Min -Yue stocks, demonstrating the low level of differentiation and a close relationship. However, STRUCTURE simulations and phylogenetic tree based on the UPGMA method supported that they are geographically different populations of the same species with distinct genetic structures. Examinations of individual admixture showed that Min - Yue stock had been contaminated by alien individuals. Moreover, the genetic structures of the two hybrid groups resembled those of their parents, especially affected more by their female parents. Finally, the values of average observed heterozygosity between parents and their ascendants were compared and tested, as a result of no detectable differences （P 〉 0. 05）.     

大黄鱼肝脏免疫保护蛋白的鉴定

本研究以大黄鱼(Larimichthys crocea)肝脏为研究对象,采用比较蛋白质组学技术分析大黄鱼免疫保护后蛋白表达水平的变化。结果发现,对照组和免疫保护组中共有20个表达水平差异显著的蛋白点,经MALDI-TOF-MS分析,获得18个差异蛋白点肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint,PMF),通过数据库查询,与免疫型受体、新型抗原受体等蛋白具有高度同源性。在此基础之上,进一步选取4个蛋白差异点(1、10、14和18号)进行Westen blot验证。结果表明,该4个蛋白差异点可以与所制备的抗体发生特异性的结合,且变化趋势与蛋白质组学分析结果一致。由此推测,免疫型受体等18个蛋白应该与大黄鱼免疫保护密切相关,所获研究结果为揭示大黄鱼免疫保护机理奠定了良好的基础。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的抗菌和抗寄生虫活性分析

近年来,我国重要经济鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）遭受了严重的海水白点病的感染,造成了巨大的经济损失。海水白点病是由体外寄生虫刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染引起,不仅能引起被感染鱼类生理的破坏,还能够引发二次细菌感染。有报道指出一些抗菌肽（antimicrobial peptides）具有抗刺激隐核虫的活性。大黄鱼hepcidin-like（命名为Lc-HepL）是从刺激隐核虫感染大黄鱼后的比较转录组中挖掘到的一个差异表达基因。本研究中,在基因和蛋白水平上分析了该抗菌肽的生物活性。刺激隐核虫感染后,qRT-PCR检测到Lc-HepL在鳃、肌肉、肝脏、头肾、肠道和脾脏6种组织中显著上调,并且上调的时间点出现在幼虫感染阶段、滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段,结果显示Lc-HepL在抗刺激隐核虫和二次细菌感染的免疫反应中发挥重要作用。在体外成功诱导并纯化的重组Lc-HepL（rLc-HepL）对某些病原菌具有剂量和时间依赖性的强抗菌活性。本研究首次探究了rLc-HepL的抗刺激隐核虫活性,显微观察结果显示其能引起幼虫细胞膜破裂、内容物外泄,该结果首次提供了大黄鱼hepcidin-like具有强抗刺激隐核虫活性证据。研究数据表Lc-HepL很可能是大黄鱼抗刺激隐核虫感染的一种重要的先天免疫因子,具有应用到未来的药物中的潜力。     

盐度骤降胁迫对大黄鱼血清生化组分的影响

以大黄鱼(Larimichthys crocea)为研究对象,通过研究急性低盐度胁迫对大黄鱼血清生化组分的影响,评估盐度骤降引起鱼体的应激反应。急性低盐度(15、8)胁迫下,在72h的实验周期中,大黄鱼血清葡萄糖(GLU)含量整体显著下降(P<0.05);血清总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)及球蛋白(GLB)含量在15盐度胁迫下呈波动变化,与对照组相比无显著性差异(P>0.05),8盐度胁迫下,TP含量呈显著下降后逐渐升高趋势;血清甘油三酯(TG)和总胆固醇(CHOL)含量在15盐度胁迫下均在初始阶段显著变化后逐渐恢复至对照组水平,而8低盐胁迫后二者含量均在实验后期(48 h和72 h)大幅度显著升高;血清中的丙氨酸氨基转移酶(ALT)和天门冬氨酸氨基转移酶(AST)含量在低盐胁迫下均显著高于对照组水平,且呈现出盐度相关性。研究结果表明,急性低盐胁迫会引起鱼体应激反应,实际生产中应避免养殖环境盐度的剧烈变化。     

小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代遗传特征分析

通过对小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代及其双亲染色体核型和线粒体COI基因序列的比较分析,旨在对其杂交遗传特性进行研究。其中染色体核型分析表明:小黄鱼的核型为2n=6sm+42t,NF=54;大黄鱼的核型为2n=2sm+22st+24t,NF=72;杂交子代为2n=8sm+12st+28t,NF=68。杂交子代和亲本在染色体数目上一致,但在组型上存在差异,可能是由于杂交过程中双亲染色体组发生了融合和重配。同时,对杂交子代及其亲本672bp的COI基因同源序列进行分析,表明杂交子代与其母本小黄鱼的序列几乎一致,利用Kitumra-2-Parameter-Distance双参数模型分析显示杂交子代与小黄鱼的遗传距离为0.011,该数值接近其种内平均遗传距离。基于COI基因片段序列构建的系统树显示,杂交子代与小黄鱼聚成一支。杂交子代在线粒体COI基因上表现出严格的母系遗传特征。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)消化道形态与组织学结构特征及其消化酶活性的研究

为了解小黄鱼(Larimichthyspolyactis)消化道结构特点及其功能与食性的相关性,采用解剖、石蜡切片、AB-PAS反应及酶活检测技术,观察研究了小黄鱼消化道的形态及组织学结构、黏液细胞定位及消化酶活性。结果显示:消化道由口咽腔(舌)、食道、胃及肠构成,食道粗短,胃卜型,肠呈"S"型弯曲,肠指数为0.63;舌上皮中分布有味蕾及少量各型黏液细胞。食道、胃及肠均由黏膜层、黏膜下层、肌层及外膜组成;食道含初级及次级突起,分别被覆复层扁平及单层柱状上皮,大量黏液细胞分布于复层上皮内,以Ⅱ型为主。胃内胃腺发达,分布有大量Ⅰ及Ⅱ型黏液细胞;胃中蛋白酶活性较高。肠上皮为单层柱状上皮,上皮层分布有各型黏液细胞,以Ⅱ型为主;肠道肌层厚度、黏膜褶皱高度及黏液细胞总密度由前往后递增;肠道中胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶及碱性磷酸酶活性较高,且后肠高于前、中肠。小黄鱼消化道形态、组织结构及酶活性分布特点与其肉食食性相适应,口咽腔(舌)及食道上皮具有较好的保护作用,胃在蛋白质消化吸收方面发挥重要作用,肠道在蛋白质、脂类、糖类、无机盐等物质的消化吸收方面起重要作用。     

三种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)是引起大黄鱼(Pseudosciaena crocea)溃疡病的3种主要致病菌.将试验大黄鱼随机分成4组,分别腹腔注射哈维氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和灭菌生理盐水,在感染后的不同时间采样,通过白细胞数量、白细胞分类计数、NBT阳性细胞数量以及溶菌酶活力的变化趋势来探讨3种致病弧菌感染对大黄鱼非特异性免疫功能的影响.结果表明,大黄鱼各项血液指标的变化主要发生在感染后的1～7 d.在人工感染的初期,各实验组大黄鱼外周血的白细胞数量、NBT阳性细胞数量呈现先增加后降低的趋势,淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比显著降低(p<0.05),单核细胞百分比显著提高(p<0.05);随着时间的延长,白细胞数量开始下降;淋巴细胞、嗜中性粒细胞百分比有所上升,7 d以后各类血细胞数量变化不显著.其中哈氏弧菌感染组在白细胞数量、NBT阳性细胞数量等多个指标上的变化最为明显.血清中溶菌酶活性显著高于脾组织,鱼体受感染后两者溶菌酶活性均较对照组有显著提高,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.研究认为反映鱼体受感染后从应激反应发生至非特异性免疫功能的发挥主要发生在病原菌感染前期,不同致病菌与大黄鱼非特异性免疫功能之间呈现一定的时效差异.     

大黄鱼选育群体与普通养殖群体部分免疫指标的比较

以本课题组选育的“闽优1 号”及未经选育的普通大黄鱼(Larimichthys crocea)养殖群体为研究对象, 比较了两者的白细胞吞噬活性、血清溶菌酶活性、杀菌活力、白蛋白及免疫球蛋白含量、血清及血细胞超氧化物歧化酶(SOD)活性等免疫指标的差异。结果表明: 选育的“闽优1 号”大黄鱼血清溶菌酶和血细胞SOD 活力显著高于对照组(P<0.05), 而血清中的免疫球蛋白含量低于普通养殖群体。在病原菌攻毒后8 d 内, 选育群体累积死亡率显著低于非选育群体, 提示非特异性免疫在大黄鱼抗病免疫的早期阶段可能起着重要作用。     

3种致病弧菌感染对大黄鱼7种酶活性的影响

大黄鱼溃疡病主要由3种致病弧菌引起:溶藻弧菌Vibrio alginolyticus、哈维弧菌V. harveyi和副溶血弧菌V. parahaemolyticus。为了解大黄鱼抗病原菌感染的免疫反应机理,对其疾病防御提供重要的理论基础,本实验将健康的大黄鱼随机分为3个实验组和1个对照组,分别注射0.2 mL的哈维弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌及灭菌生理盐水。在人工感染后的第0,1,2,4,7,10,13,16,20天分别采样,通过测定每组大黄鱼血清中7种免疫相关酶活性,比较这3种致病弧菌对大黄鱼影响的差异性。结果表明:在感染后的1～10 d,实验组大黄鱼血清中血清溶菌酶(LSZ)、酸性磷酸酶(ACP)、过氧化物酶(POD)、髓过氧化物酶(MPO)的活性变化,总体表现为先升高、后降低再逐渐升高最后趋于-致的现象,且不同病原菌之间存在-定的时效差异。 碱性磷酸酶(AKP)对入侵体内的哈氏弧菌反应较敏感,ACP、POD和MPO对溶藻弧菌反应较敏感,LSZ和PO对副溶血弧菌反应较敏感。