大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

不同地理种群大黄鱼染色体核型的比较研究

大黄鱼(Pseudosciaena crocea(Richardson)),隶属于鲈形目(Perciformes),石首鱼科(Scieani-dae),黄鱼属(Pseudosciaena),是我国重要的海水养殖种类.近年来,经过长期的人工繁育和人工养殖,大黄鱼的性状有了较大的变化.主要表现为个体小型化,性成熟提前,抗病力下降等.目前有关大黄鱼遗传背景的研究还十分缺乏,相关的研究仅见于国内学者对养殖、野生大黄鱼的染色体核型、同工酶酶谱、不同群体遗传多样性水平的研究[1~7],这些研究多是针对我国沿海3个大黄鱼地理种群之一的闽粤东族进行的.     

大黄鱼(Larimichthys crocea)ISG15基因单核苷酸多态性及与抗病性状的相关性研究

由哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)等细菌感染引起的弧菌病对我国大黄鱼(Larimichthys crocea)的养殖造成了严重危害。通过哈维氏弧菌人工感染大黄鱼建立易感组和抗病组,采用PCR扩增和直接测序法对大黄鱼干扰素刺激基因ISG15双拷贝(ISG15-1和ISG15-2)进行单核苷酸多态性(SNPs)检测和分型,并与其哈维氏弧菌抗性进行关联分析。结果表明,从大黄鱼ISG15-1和ISG15-2基因中分别筛选到10个和4个SNP位点并进行了成功分型。经统计分析,ISG15-1基因的186G/C和318C/T位点以及ISG15-2基因的297G/T位点的基因型频率和等位基因频率在易感群体和抗病群体中均存在极显著差异,表明这3个SNP位点与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关。连锁不平衡分析结果显示,ISG15-1的SNPs可形成1个单倍块和11种单倍型,而ISG15-2的SNPs可形成1个单倍块和5种单倍型。其中,ISG15-1基因的单倍型H2(CCCCGGTACC)、H6(TCCCACTGTC)和H9(TCCCAGTGCC)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性显著相关;ISG15-2基因的单倍型H1(CCCG)和H4(TCCG)与大黄鱼哈维氏弧菌抗性极显著相关。这些ISG15-1和ISG15-2基因的SNP位点以及单倍型可以作为抗哈维氏弧菌病大黄鱼选育的候选分子标记。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)线粒体基因组结构与特征

采用长片段扩增策略,获得鲈形目石首鱼科黄鱼属小黄鱼的线粒体基因组全序列。组装分析结果表明,其长度为16470bp,H链碱基组成呈明显反G偏倚,G含量仅为16%。13个蛋白质基因起始密码子均为ATG。COI基因的终止密码子为AGA,ND1和ND3基因为TAG,COII、ND4和Cytb基因为不完全终止密码子T,其余7个基因都是完整的TAA。在小黄鱼mtDNA中发现2个特殊发夹结构,一个是轻链复制起始区(OL)的发夹环,位于tRNA簇,环区T含量仅为9%,而G含量达45%,这与哺乳动物和爪蟾该区域富含T有所不同。另一个假定发夹结构位于ATP6基因末端,这种二级结构可能与准确转录有关。该mtDNA控制区长度为799bp,5′端含有9个连续TA串联重复和2个5′-ATGTA---TACAT-3′重复,与已报道的鱼类扩展终止相关序列模式恰恰相反;中央控制区仅识别出CSB-E结构;保守序列区含有CSB-1,2,3,其中CSB-2具有高度保守性。对小黄鱼和大黄鱼的mtDNA比较进化研究,根据分子钟假说,估计二者线粒体基因组的进化分歧时间为4.8百万年前。     

大黄鱼肌浆蛋白和肝酯酶同工酶的电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)技术,对大黄鱼肌浆蛋白(Pm)和肝酯酶(EST)同工酶进行研究。结果表明,大黄鱼的Pm电泳酶谱不存在个体间差异,而肝EST酶谱复杂,Est-2和Est-3为多态位点。X2检验表明,这两个多态位点等位基因频率都符合Hardy-Weinberg平衡。     

海水网箱养殖大黄鱼弧菌病的病原菌

从网箱养殖患病的大黄鱼（Ｐｓｅｕｄｏｓｃｉａｅｎａ ｃｒｏｃｅａ）肝、肾、脾等组织分离两株病原菌,进行纯化培养、人工感染、药敏试验及菌种鉴定等研究,根据形态及生理生化特征,致病菌定为溶藻弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）。药敏实验的结果表明,氯霉素、庆大霉素、妥布霉素和复方新诺明等对致病菌有较强的抑制作用。     

小黄鱼(Larimichthys polyactis)精子的生理特性及超低温冷冻保存研究

为了解养殖小黄鱼精子的生理特性及超低温冷冻保存效果,用计算机辅助精子分析系统(CASA)检测了小黄鱼精子的运动参数及盐度、pH、葡萄糖、离子等环境因子的变化对其精子活力的影响;探究了稀释液、抗冻剂、稀释比及降温高度等对精子冷冻保存效果的影响。结果显示:小黄鱼精液的精子密度为(6.92±1.20)×109/mL。精子经自然海水激活后,运动率、运动时间及寿命分别为(59.31±4.85)%、8.44±0.87min及12.20±0.50min,直线运动速率(VSL)、曲线运动速率(VCL)及平均路径运动速率(VAP)分别为11.96±5.21、25.38±7.19和22.33±6.88μm/s。精子运动适宜的盐度范围为25—30、适宜的pH范围为7.5—8.5,精子在盐度25或pH8.0的海水中活力较好。精子激活效果较好的葡萄糖浓度为0.7—0.9mol/L;浓度0.9mol/L时,精子活力较好。精子激活效果较好的KCl、NaCl、MgCl2及CaCl2溶液浓度分别为0.4—0.5、0.4—0.6、0.7—1.0和0.2—0.3mol/L;精子在KCl及CaCl2溶液中活力相对较差,运动率等参数显著低于对照组;精子在不同人工海水中的运动率显著低于自然海水中的运动率,但精子在单一离子缺陷型人工海水及全人工海水中的运动率无显著差异。以0.25mL麦细管为冻存管, 6种稀释液、不同浓度的4种抗冻剂、5种稀释比及5种降温高度对小黄鱼精子冷冻保存效果的影响试验发现,以HBSS液1︰3稀释精液,添加10%DMSO及15%PG为抗冻剂,液氮面上3.5cm处降温5min后投入液氮中保存效果较好,冻精解冻后运动率达(43.57±2.59)%及(43.06±6.77)%。     

神经肽FF在小黄鱼(Larimichthys polyactis)性腺发育早期的表达与定位分析

神经肽FF是属于RFamide相关肽家族中的一种八肽,在多种生物过程中具有调节功能.本文开展了小黄鱼(Larimichthys polyactis)神经肽FF 相关基因(LpNPFF:Accession No.MT012894)的组织表达与定位分析研究.实时荧光定量PCR结果显示,小黄鱼神经肽FF基因在性未成熟期(第Ⅱ...     

拮抗菌对病原性溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)粘附大黄鱼(Pseudosciaena crocea)表皮粘液的影响

采用3H-TdR同位素示踪法研究了病原性溶藻弧菌和9株拮抗菌对大黄鱼表皮粘液的粘附动力学。结果表明,10株细菌的粘附作用都符合饱和粘附动力学特征;R4、R13和R32等3株拮抗菌的最大粘附量高于溶藻弧菌;9株拮抗菌的分离常数都高于溶藻弧菌;R32的亲和指数大于溶藻弧菌,其余8株拮抗菌的亲和指数都小于溶藻弧菌。测定了9株拮抗菌对病原性溶藻弧菌粘附大黄鱼表皮粘液的竞争、排斥和置换作用,结果显示:9株拮抗菌在竞争条件下都能极显著减少溶藻弧菌对表皮粘液粘附(P<0.01);在粘附排斥方面,R4、R13、J26、J28、J312、Y59等6株拮抗菌能显著排斥病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用(P<0.05);在粘附置换方面,J26、J28等2株拮抗菌能极显著(P<0.01)降低病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附量。研究结果表明,病原性溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液有较强的粘附作用;9株拮抗菌能够抑制溶藻弧菌对大黄鱼表皮粘液的粘附作用,其中竞争作用效果最好,排斥作用次之,置换作用的效果最差;拮抗菌对病原菌粘附的抑制效果受多种因素的影响,各菌株的粘附动力学参数有重要的影响作用。     

病原分离鉴定及致病性研究

于2013年4月从宁德患内脏白点病大黄鱼(Pseudosciaena crocea)中分离得到两株优势菌NZBD9和NZBD11, 这两株菌在16—19°C条件下回归感染能引起大黄鱼内脏白点病, 而在7—10°C和24—27°C条件下同样的人工感染不能致病, 从而证实这两株菌为大黄鱼内脏白点病的病原菌。经16S rDNA基因的测序和时间飞行质谱微生物鉴定仪分析, NZBD9 和NZBD11同为变形假单胞菌。药敏性实验结果显示NZBD9对庆大霉素、诺氟沙星和四环素等7种药物高度敏感。组织病理学观察结果显示病鱼的肝脏、脾脏、头肾等组织中均出现明显病症, 如变性和坏死。