基于DNA条形码对南极Yelcho站周边海域鱼类种类鉴定

南极鱼类是南极海洋生态系统的重要组成部分, 在食物网的物质循环和能量流动中起着重要的作 用。利用中国第32 次南极考察暨中智第2 次联合南极半岛综合科学考察采集Yelcho 站周边海域南极鱼类, 并基于形态学和DNA 条形码技术对其进行种类鉴定。序列相似性结果显示仅2 尾鱼类能准确鉴定到种, 剩 余6 尾属于模糊种; 结合GenBank 中的同源序列对其进行系统发育分析, 结果显示所有样品能明显分为4 个组群, 且各物种的最小种间遗传距离均高于该物种的最大种内遗传距离, 存在明显的条形码间隙, 证明 各物种鉴定结果的有效性。8 尾样品内存在3 个有效种, 南极鱼科7 尾, 裸南极鱼科1 尾, 在一定程度上反 映出Yelcho 站周边海域鱼类在物种组成和生物量上均以南极鱼科鱼类为主。     

中部太平洋大眼金枪鱼种群遗传结构的初步研究

大眼金枪鱼是世界最重要的渔业资源之一,经济价值较高,捕捞压力的加大使中部太平洋大眼金枪鱼过度捕捞程度愈发严重。开展种群遗传结构研究将为大眼金枪鱼资源的可持续利用与开发提供科学依据。本文以取自中西太平洋和中东太平洋共182尾大眼金枪鱼个体为研究对象,分析研究其线粒体DNA控制区第一个高变区（the first hypervariable region,HVR-1）457bp的序列,共发现115个变异位点,定义了178种单倍型。序列多样性分析结果显示8个采样点核苷酸多样性在0.03074-0.04362间,单倍型多样性在各个采样点都较高,变动范围在0.996-1.000之间;分子方差分析显示99.97%的遗传变异性来自于种群内;群体间的高基因交流值Nm和低分化指数Fst揭示中东太平洋与中西太平洋群体间基因交流频繁,不存在显著的遗传分化。     

福建省沿海鱚属（Sillago）鱼类新纪录种——中国鱚（Sillago sinica Gao and Xue,2011）

本研究报道了在福建省晋江和厦门近海采集到的新记录种——中国鱚,将其分布区向南延伸至福建省沿海,并对采集到的中国鱚进行形态特征的重新描述,及扩增其DNA条形码.中国鱚的主要鉴别特征为：第一背鳍鳍膜具不规则的、呈弥散状的黑色斑点,由前往后逐渐稀疏;第二背鳍沿鳍条具3～4行规则的黑色斑点;侧线上鳞数为6～7;脊椎骨数为37～39.结合Gen Bank中鱚属鱼类的同源序列进行比对研究,结果显示本研究采集到的中国鱚与中国鱚模式种聚类到一起,并与其余种类明显分开,在遗传距离和氨基酸水平上与其他种类产生了明显地分化,进一步证明了DNA条形码能高效快速的鉴别鱚属鱼类.本研究为鱚属鱼类分类与研究提供理论基础,通过调查发现中国鱚主要分布在有大量淡水注入的河口区,南至韩国光阳沿海,北至中国福建省沿海,数量较少并不能形成渔汛.     

基于16S rRNA基因的三种枝吻纽虫系统发育关系分析

测定了湛江枝吻纽虫（Dendrorhynchus zhanjiangensis）、中华枝吻纽虫（Dendrorhynchus sinensis）及疣多枝吻纽虫（Polydendrorhynchus papillaris）线粒体16S rRNA基因部分片段序列,结合从GenBank下载的其他纽虫序列,对它们之间的系统发育关系进行了分析.26个中华枝吻纽虫个体共检测到长度为467-468 bp的9个单倍型,5个湛江枝吻纽虫个体的长度均为469 bp,共检测到3个单倍型,2个疣多枝吻纽虫个体的长度均为474 bp,共享1个单倍型;核苷酸序列A、T、G、C的含量相似,碱基组成均表现出AT含量偏倚,即AT含量明显高于GC含量.中华枝吻纽虫9个单倍型之间的遗传距离和湛江枝吻纽虫3个单倍型之间的遗传距离均为0.002 1-0.004 3;而3种枝吻纽虫16S rRNA基因序列彼此之间的遗传距离却均超过0.24,显示它们之间的遗传差异特别大,分子系统树（NJ）的拓扑结构也显示,3种枝吻纽虫没有聚成1支,而是各自成支,结果支持3种枝吻纽虫分别为独立有效物种.中华枝吻纽虫与2种脑纹纽虫（Cerebratulus lacteus、C.marginatus）的遗传距离分别为0.154、0.169,明显低于与其同属的湛江枝吻纽虫的遗传距离（0.242）,表明中华枝吻纽虫与前两者的亲缘关系相对较近,而与后者的亲缘关系相对较远;在NJ树上,中华枝吻纽虫没有与湛江中华枝吻纽虫聚为1支,而是其9个单倍型聚为1支后,与2种脑纹纽虫（C.lacteus、C.marginatus）聚为1支,且有高达94%的支持率,这表明枝吻纽虫属（Dendrorhynchus）并非单系,也提示将中华枝吻纽虫划入脑纹纽虫属（Cerebratulus）会更合适.     

条斑紫菜叶状体DNA的高效制备

探索优化研磨条斑紫菜叶状体提取DNA的条件,建立一套简单、快速、高效的高通量研磨破碎方法。钢珠研磨80s时的破碎效果与液氮研磨破碎效果相近,因此选用80s作为研磨时间。利用2种样品材料(干燥和新鲜)、4种研磨介质(钢珠Φ2.3mm、陶瓷珠Φ1mm、石英砂0.270~0.707mm和玻璃珠Φ0.5mm)、3个研磨介质体积梯度(0.1、0.2和0.3mL)设计研磨实验。结果发现,钢珠的破碎效果最好,玻璃珠的破碎效果最差;石英砂和玻璃珠组研磨干燥材料所得DNA完整性最好,4种研磨介质研磨新鲜材料所得DNA出现了降解,钢珠和陶瓷珠研磨干燥材料所得DNA降解最严重;研磨介质的体积对样品的破碎程度、DNA得率和DNA质量没有显著性影响;4种研磨介质研磨干燥和新鲜材料所提DNA的纯度均较高。80s的研磨实验中显示,钢珠组能有效的破碎干燥和新鲜材料,获得DNA的纯度和得率都比较高,但是DNA出现了降解。在此基础上设置了0.2mL钢珠研磨干燥和新鲜材料5~40s的时间梯度。实验结果显示,钢珠在5~40s时均能有效的破碎干燥、新鲜2种样品材料。干燥材料研磨5~40s时,DNA有明显的主条带,DNA得率随着研磨时间的延长有所增加,DNA质量较好,且能用于限制性内切酶酶切实验;新鲜材料研磨5~40s时,DNA有明显的主条带,DNA得率没有显著性差异,DNA质量较好,也能用于限制性内切酶酶切实验。所以本文认为破碎干燥和新鲜2种样品材料制备高质量条斑紫菜DNA的最佳条件为:研磨介质为0.2mL钢珠、研磨速度为6 800r/min、研磨时间为5s。     

仿刺参(Apostichopus japonicus)和海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁多肽的响应面法酶解和N末端测序

为充分开发利用海参资源,优化海参体壁酶解工艺,鉴定海参多肽,本文以水解度为指标,设计了3因素(时间、温度和加酶量)3水平的响应面实验,得到海参水解的最优条件是:仿刺参(Apostichopus japonicus)体壁在加酶量1.97%、温度55.7°C、水解136.8min的条件下,水解度为83.39%;海地瓜(Acaudina leucoprocta)体壁在加酶量1.70%、温度55.4°C、水解115.6min的条件下,水解度为63.68%。之后通过使用超滤膜、反相高效液相色谱(RP-HPLC)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)技术和蛋白测序仪等分析手段从水解产物中分离鉴定出4种多肽。其中,经N端序列鉴定出仿刺参多肽S1、S2氨基酸残基序列分别为Gly-Pro-Val-Gly-Ala-Ser-Gly-Pro-Gln-Gly-ProGln-Gly-Pro-Gln-Gly-Leu-Ser-Ala-Leu和Trp-Pro-Pro-Gly-Asn-Ser-Gly-Ile-Gln-Gly。海地瓜多肽A1和A2氨基酸残基序列分别为Gly-Ala-Asn-Gly-Asn和Trp-Leu-Pro-Gly-Asp-Thr-Gly-Pro-Gln-GlyVal-Thr-Gly-Pro-Val-Gly-Pro-Ala-Gly。     

莱州湾近岸海域浮游纤毛虫群落组成和季节变化

浮游纤毛虫是真核微型生物的重要类群,在浮游生态系统中发挥着重要作用。利用传统形态学与高通量测序技术相结合的方法,于2020年9月至2021年8月对莱州湾三山岛近岸浮游纤毛虫进行每月两次的调查。对环境DNA的18S rRNA基因的V4区进行高通量测序,结果显示无壳寡毛类(占纤毛虫序列丰度的40.14%)和砂壳纤毛虫(10.67%)是优势类群,并且具有明显的季节变化。无壳寡毛类在冬季序列相对丰度最高,主要由急游虫属(Strombidium)和急游虫科未定类群(Strombidiidae_X)组成;砂壳类在春夏季序列相对丰度最高,主要由砂壳目未定类群(Tintinnida_XX)和拟铃虫属(Tintinnopsis)组成。浮游纤毛虫群落的β多样性呈现显著的季节变化,而α和β多样性在站点间差异均不显著。与环境因子的RDA分析显示,总有机碳和溶解氧含量是影响纤毛虫群落结构的主要环境驱动因子。形态学方法共检获鉴定17种纤毛虫,分别隶属于7个属,其中砂壳类在多样性和检获频率上均为最优势类群。研究填补了莱州湾三山岛海域浮游纤毛虫的多样性、群落结构和季节动态研究的空白,同时为深入研究温带海湾近岸浮游纤毛虫群落的长期变化规律以及对环境因子的响应机制提供本底资料。     

熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎组织菌群构成及功能的比较分析

为探究健康二龄熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎5种组织间细菌群落组成、多样性和功能的差异,本研究利用Illumina高通量测序技术和PICRUSt2对3种牡蛎5种组织中的细菌群落构成及其潜在功能进行了比较分析。结果显示,在3种牡蛎的5种组织中共鉴定到6 020个细菌OTUs,其中3种牡蛎整体间共有的OTUs数占42.4%。3种牡蛎5种组织中的优势菌主要隶属于γ-变形菌纲（γ-proteobacteria）、α-变形菌纲（α-proteobacteria）、柔壁菌门（Tenericutes）和厚壁菌门（Firmicutes）。弧菌属（Vibrio）在熊本牡蛎的鳃、外套膜、性腺和血淋巴中的相对丰度均显著高于长牡蛎和葡萄牙牡蛎,且分别在熊本牡蛎外套膜、长牡蛎性腺和葡萄牙牡蛎血淋巴中相对丰度最高,但均在3种牡蛎肝胰腺中相对丰度最低。3种牡蛎5种组织间的菌群多样性均有所差异,其中在熊本牡蛎鳃、葡萄牙牡蛎外套膜和长牡蛎血淋巴中菌群多样性最高,而在熊本牡蛎血淋巴、葡萄牙牡蛎性腺和长牡蛎肝胰腺中菌群多样性最低。在不区分组织的情况下,3种牡蛎整体间的菌群结构存在显著差异（r=0.661,p<0.001）。此外,在熊本牡蛎肝胰腺、葡萄牙牡蛎鳃和长牡蛎血淋巴中细菌参与的能量代谢相关功能通路的相关丰度显著高于对应牡蛎的其他组织。本文结果表明,熊本牡蛎、葡萄牙牡蛎和长牡蛎组织内的菌群构成存在差异,且由细菌介导的功能也随牡蛎种类和组织类型发生改变。     

高通量深海海水原位采样及分级过滤系统

深海悬浮颗粒物((含浮游微生物)的研究具有重要意义,但深海大洋中多数海域悬浮物的丰度很低,其研究需要较多水样(一次过滤水样超过200L,甚至达到1000L以上),传统方法用采水器采水后甲板过滤费时费力。基于此,本文研制了一种高通量深海海水采样及分级过滤装置,装置包括总成深海泵、过滤装置、数据采集与控制装置,以及支撑架体、供电部件、连接机构和流量计等辅助部件。过滤装置分三级过滤(分别放置0.22、1和5μm孔径的滤膜,并可根据需要更换组合),控制装置采用深度触发和时间触发两种工作模式,并可配套安装CTD、荧光计等海洋环境参数测量设备。针对调查站点,将若干套(如3套)高通量深海海水采样及分级过滤系统分一定间隔悬挂于深海绞车缆线上,可以同步进行相应水层的海水原位过滤,从而形成多水层同步高通量原位多级过滤,以获取浮游微生物等悬浮颗粒物样品。该原位取样系统具有多层同步高通量过滤和分级采样的特点,现已被应用于海洋科考航次中,为深海悬浮颗粒物(含浮游微生物等)的研究提供了一种简约高效的样品获取方法。