琼胶降解菌F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究

利用琼胶作为唯一的碳源从青岛太平角海域的海水和红藻样品中筛选分离得到一株高产琼胶酶的海洋菌F-6,对其最适的产酶条件,利用琼胶酶分离条斑紫菜的原生质体和原生质体的培养进行研究。结果表明,通过单次单因子和正交实验确定琼胶降解菌株F-6最适产酶培养基配方为(W/V):琼胶0.7%;酵母粉0.3%;蛋白胨0.5%;NaCl2.0%;K2HPO40.1%;CaCl20.02%;MgSO4·7H2O0.05%;FeSO4·7H2O0.002%;起始pH=7.5,最适的发酵产酶条件为:26℃培养36h。经条件优化后,粗酶液的酶活高达631.6U/ml。发酵液经过6000g离心30min得到粗酶液,粗酶液经过8k分离膜超滤,加入1mol/L渗透剂,0.22μm滤膜过滤除菌后降解条斑紫菜组织块,成功地分离得到大量的紫菜原生质体,其产率为3×106个原生质体/g新鲜紫菜组织。原生质体经初步培养发育成愈伤组织,其成活率为60%。     

富含古罗糖醛酸的褐藻多糖生产菌株的构建

为获得古罗糖醛酸(Guluronate)含量高的细菌胞外褐藻多糖,利用PCR从海洋细菌Pseudomonassp.QDA中克隆了其甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因(algG),连接入质粒pMF 54Km,构建了重组表达载体pMF54 Km-algG。利用三亲接合法将pMF54 Km-algG转入菌株QDA中,获得algG过量表达重组菌株QDA-G1。H-NMR测定结果表明,QDA-G所产的褐藻多糖中β-D-甘露糖醛酸(M)与它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)的比值为0.38,G的质量分数达到74.2%,比野生菌株QDA提高了26.4%。且重组菌株遗传稳定性良好,连续传代20代后,M/G的比值无明显变化。     

厦门文昌鱼(Branchiostoma belcheri Gray)种群杂合性研究

应用聚丙烯凝胶电泳技术,研究了厦门海域四个野生文昌鱼种群的杂合度缺乏和过量情况.在测定的7个酶系统中,共有14个等位酶基因位点,分别为Aat-1、Amy-1、Amy-2、Amy-3、Amy-4、Me-1、Me-2、Mdh-1、Mdh-2、Sod-1、Sod-2、Est-1、Est-2、Per-1.多态位点有8个,分别为Sod-1、Aat-1、Me-1、Me-2、Mdh-1、Mdh-2、Est-2、Amy-2.结果表明,在大嶝岛种群、南线至十八线东端种群、南线至十八线西端种群及黄厝种群中,多态位点Sod-1、Mdh-2、Me-2、Aat-1显著偏离H-W平衡标准(P<0.05),而位点Me-1、Mdh-1、Est-2符合H-W平衡标准(P>0.05).多态位点Amy-2除南线至十八线东端种群显著偏离H.W平衡标准(P<0.05)外,其它三个种群的多态位点Amy-2均符合H-W平衡标准(P>0.05).在所有的8个多态位点中,只有大嶝岛和黄厝两个种群的Amy-2位点表现为杂合子缺失(F>0),其它种群的多态位点均表现为杂合子过量(F<0).造成杂合体缺失的主要原因可能是自然选择、近交、哑等位基因等.杂合体的缺失会导致某些基因从该物种的基因库中消失,从而降低了物种的遗传多样性,同时也使物种对环境的适应能力降低.     

西施舌(Coelomactra antipuata)群体遗传多样性与分化的研究

采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对广西北海、福建漳港和江苏启东3个西施舌自然群体的7个等位酶12个位点进行检测分析.结果表明,西施舌群体的遗传多样性较高,平均每位点等位基因数目(A)范围为1.5833-2.0000、平均每位点有效等位基因数目(Ae)范围为1.2850-1.5373、多态位点百分数(P)为33.33%、观察杂合度(Ho)为0.2389-0.3083、期望杂合度(He)为0.1496-0.2041之间.西施舌群体间有一定的遗传分化,遗传分化系数(FST)为0.0719,福建漳港群体与广西北海群体之间的FST为0.0413,但福建漳港群体和广西北海群体与江苏启东群体之间的FST为0.0505.     

黄斑篮子鱼去毒相关基因的克隆与肝脏组成型表达分析

从基因水平探讨海洋鱼类对海洋藻毒素的去毒分子机理。采用RT-PCR法成功克隆了黄斑篮子鱼Siganus oramin肝脏I时相代谢酶细胞色素P450 1A(CYP1A)、II时相代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)和rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70 (HSP70)、alpha 1型钠钾ATP酶(ATP1A1)及β-肌动蛋白(beta-actin, ACT)基因cDNA核心序列,序列分别长879 bp、582 bp、588 bp、660 bp、749 bp和554 bp。序列同源性分析发现,属鲈形目的黄斑篮子鱼CYP1A、GSTA和GSTR与同属鲈形目的牙鲆Paralichthys olivaceus、欧洲鲽Pleuronectes platessa、真鲷Pagrus major、鲤形目的斑马鱼Brachydanio rerio 相应氨基酸序列同源性较高,CYP1A和GSTA与非洲爪蟾(两栖类)、鸡(鸟类)、小鼠、大鼠和人(哺乳类)相应氨基酸序列同源性低,这可能与鱼类I、II时相去毒酶基因承担水环境毒素去毒代谢的特殊功能有关;而HSP70、ATP1A和β-肌动蛋白在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中均有较高的同源性,这可能与这些基因在机体中承担的最基本的生命功能相关。应用半定量RT-PCR的方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在指数期增长范围内分别得到了CYP1A、GSTA、GSTR、HSP70和ATP1A1 mRNA与β-肌动蛋白mRNA (%)的比值,确定黄斑篮子鱼肝脏去毒相关基因的组成型表达水平。其中,黄斑篮子鱼肝脏CYP1A、GSTA和GSTR基因组成型表达相对较高,HSP70和ATP1A1基因组成型表达相对较低,这可能与不同基因在黄斑篮子鱼海洋藻毒素去毒分子机理中承担的作用相关,为海洋藻毒素在海洋鱼类中的积聚及代谢去毒分子机制的研究提供了相关数据。     

极地产适冷脂肪酶菌株的酶学性质研究

从南北极环境样品中分离到7株产脂肪酶的细菌,经16SrDNA序列分析表明,这些细菌分别属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）．采用p-NPP法对这7株细菌所产的脂肪酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度在30～40cC、最适作用pH值在7—8之间,在低温下能保持较高的剩余活力,对热敏感,属于适冷脂肪酶．其中假交替单胞菌（Psychrobacter sp．7342）所产脂肪酶具有低温下酶的剩余活力高、有效作用温度和pH范围广、热稳定性较好及对多种金属离子抗性强等特点．该菌株能利用多种单一氮源和碳源产酶,最适产酶温度为25℃．在此基础上进行正交实验分析得到了该菌株的最佳发酵条件为：蛋白胨和淀粉含量各为1．33％,酵母膏含量为0．3％,温度为25℃．     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

金属离子对凡纳对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活力的影响

本文报道了金属离子对凡纳对虾N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶 (EC3. 2. 1. 52)活力的影响.结果表明,Li 、Na 和K 等对该酶活力没有任何效应.Ca2 、Mg2 、Mn2 对该酶有激活作用,而Ba2 、Al3 、Fe3 、Zn2 、Co2 、Cd2 、Hg2 、Pb2 和Cu2 对该酶活力均具有一定的抑制作用.以Hg2 的抑制作用最显著,Hg2 含量为 1. 5mmol/dm3 时可使酶活力完全丧失.进一步研究Zn2 的抑制作用动力学,结果表明:Zn2 对该酶的抑制作用属可逆的非竞争性类型,抑制常数为11. 95mmol/dm3.     

一种优化模糊度搜索方法的研究

对于高精度测量和导航,GPS载波相位整周模糊度的快速求解仍然是一个难点,尤其对于单频接收机。提出一种快速求解整周模糊度的方法,其基本思想采用分步求解,首先应用最小二乘模糊去耦调节法(LAMBDA)搜索出来的模糊度作为初始值,然后应用卫星分组方法降低搜索维数,并应用极大似然准则,构造搜索函数,最后应用最优化原理,搜索出最优的模糊度参数,并从三个方面对其进行检验,即RATIO检验,OVT检验,多项式拟合残差检验。为验证该算法,我们用单频GPS接收机进行了实验,利用本文方法在11 S以内正确确定了模糊度,其基线长误差小于3MM,表明该方法不但可以改进模糊度的搜索速度,而且可以进一步提高其可靠性和成功率。该方法可广泛应用于定向及姿态测量。