绿藻氢化酶及其产氢代谢的分子生物学研究进展

随着全球工业的迅猛发展,对能源的需求量大幅增加,由于不可再生的矿物能源储量有限,导致能源危机逐渐映现,因此,开发可再生的洁净新能源成为亟待解决的全球性问题.H2由于其能量密度高,燃烧后只生成水,不造成任何污染,成为最理想的可再生能源之一.在各种制氢方法中,绿藻制氢以太阳能为能源,以水为原料,通过光解水制取H2,是目前生物制氢技术研究的热点.     

多效唑对2种海洋微藻生长和抗氧化酶活性的影响

运用实验生态学和生物化学的方法,研究了多效唑对青岛大扁藻(Platymonas helgolandica)和绿色巴夫藻(Pavlova viridis)生长和抗氧化酶活性的影响.结果表明:低浓度(≤5 mg/L)多效唑能促进绿色巴夫藻的生长,与对照组相比,多效唑处理组的干重、叶绿素a、可溶性糖和蛋白质含量均有所增加(p<0.05),而低浓度(≤5 mg/L)多效唑对青岛大扁藻的生长无明显影响;高浓度(≥15 mg/L)多效唑可显著抑制青岛大扁藻和绿色巴夫藻的生长,多效唑处理组的干重、叶绿素a、可溶性糖和蛋白质含量均低于对照组(p<0.05).多效唑对青岛大扁藻和绿色巴夫藻的96 h-EC50值分别是28.6 mg/L和24.9 mg/L. 2种微藻经不同浓度多效唑处理后,细胞内抗氧化防御系统的关键性酶超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)和过氧化物酶(peroxidase, POD)均表现为低浓度(≤5 mg/L)的诱导作用和高浓度(≥15 mg/L)时的抑制作用;不同浓度多效唑处理后,2种微藻细胞内过氧化氢酶(catalase, CAT)活性均降低.     

脂肪肝病变大黄鱼肝脏脂肪酸组成、代谢酶活性及抗氧化能力的研究

脂肪肝病变在人工养殖大黄鱼(Pseudosciaena crocea)中非常普遍,本试验研究了大黄鱼脂肪肝的发生机制,为寻找解决大黄鱼脂肪肝的有效途径提供基础资料.试验鱼取自中国东海,养殖方式和饲料来源相同,根据肉眼和组织学观察分为正常肝脏、轻微脂肪肝和严重脂肪肝3类.分别测定了正常大黄鱼和具有脂肪肝症状的大黄鱼肝脏总脂脂肪酸组成的变化、相应脂肪酸合成酶、抗氧化酶以及丙二醛含量的变化.试验结果显示,随着大黄鱼脂肪肝症状严重程度增加,肝脏总脂饱和脂肪酸和n-3多不饱和脂肪酸比例显著降低(P<0.05),单不饱和脂肪酸比例显著上升(P<0.05).其中严重脂肪肝花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)比例较正常鱼分别降低了89%,79%和78%.严重脂肪肝大黄鱼的异柠檬酸脱氢酶和6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性显著高于正常鱼(P<0.05);轻微脂肪肝鱼的转氨酶活性显著低于正常鱼(P<0.05);具有脂肪肝症状的大黄鱼超氧化物歧化酶和过氧化氢酶活性均高于正常鱼.丙二醛含量则随大黄鱼脂肪肝病变程度加剧而显著增加(P<0.05).通过分析认为,过量单不饱和脂肪酸沉积在肝脏中,导致脂肪酸合成代谢发生紊乱,可能是造成大黄鱼脂肪肝的主要原因;肝脏ARA含量大量减少使脂肪肝大黄鱼抗应激能力降低,而肝脏脂肪酸过氧化程度升高,进一步破坏肝脏的正常功能.     

西施舌(Coelomactra antipuata)群体遗传多样性与分化的研究

采用不连续垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术,对广西北海、福建漳港和江苏启东3个西施舌自然群体的7个等位酶12个位点进行检测分析.结果表明,西施舌群体的遗传多样性较高,平均每位点等位基因数目(A)范围为1.5833-2.0000、平均每位点有效等位基因数目(Ae)范围为1.2850-1.5373、多态位点百分数(P)为33.33%、观察杂合度(Ho)为0.2389-0.3083、期望杂合度(He)为0.1496-0.2041之间.西施舌群体间有一定的遗传分化,遗传分化系数(FST)为0.0719,福建漳港群体与广西北海群体之间的FST为0.0413,但福建漳港群体和广西北海群体与江苏启东群体之间的FST为0.0505.     

黄斑篮子鱼去毒相关基因的克隆与肝脏组成型表达分析

从基因水平探讨海洋鱼类对海洋藻毒素的去毒分子机理。采用RT-PCR法成功克隆了黄斑篮子鱼Siganus oramin肝脏I时相代谢酶细胞色素P450 1A(CYP1A)、II时相代谢酶alpha型谷胱甘肽S-转移酶(GSTA)和rho型谷胱甘肽S-转移酶(GSTR)、热休克蛋白70 (HSP70)、alpha 1型钠钾ATP酶(ATP1A1)及β-肌动蛋白(beta-actin, ACT)基因cDNA核心序列,序列分别长879 bp、582 bp、588 bp、660 bp、749 bp和554 bp。序列同源性分析发现,属鲈形目的黄斑篮子鱼CYP1A、GSTA和GSTR与同属鲈形目的牙鲆Paralichthys olivaceus、欧洲鲽Pleuronectes platessa、真鲷Pagrus major、鲤形目的斑马鱼Brachydanio rerio 相应氨基酸序列同源性较高,CYP1A和GSTA与非洲爪蟾(两栖类)、鸡(鸟类)、小鼠、大鼠和人(哺乳类)相应氨基酸序列同源性低,这可能与鱼类I、II时相去毒酶基因承担水环境毒素去毒代谢的特殊功能有关;而HSP70、ATP1A和β-肌动蛋白在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中均有较高的同源性,这可能与这些基因在机体中承担的最基本的生命功能相关。应用半定量RT-PCR的方法,以β-肌动蛋白作为外参照,在指数期增长范围内分别得到了CYP1A、GSTA、GSTR、HSP70和ATP1A1 mRNA与β-肌动蛋白mRNA (%)的比值,确定黄斑篮子鱼肝脏去毒相关基因的组成型表达水平。其中,黄斑篮子鱼肝脏CYP1A、GSTA和GSTR基因组成型表达相对较高,HSP70和ATP1A1基因组成型表达相对较低,这可能与不同基因在黄斑篮子鱼海洋藻毒素去毒分子机理中承担的作用相关,为海洋藻毒素在海洋鱼类中的积聚及代谢去毒分子机制的研究提供了相关数据。     

极地产适冷脂肪酶菌株的酶学性质研究

从南北极环境样品中分离到7株产脂肪酶的细菌,经16SrDNA序列分析表明,这些细菌分别属于假交替单胞菌属（Pseudoalteromonas）和嗜冷杆菌属（Psychrobacter）．采用p-NPP法对这7株细菌所产的脂肪酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度在30～40cC、最适作用pH值在7—8之间,在低温下能保持较高的剩余活力,对热敏感,属于适冷脂肪酶．其中假交替单胞菌（Psychrobacter sp．7342）所产脂肪酶具有低温下酶的剩余活力高、有效作用温度和pH范围广、热稳定性较好及对多种金属离子抗性强等特点．该菌株能利用多种单一氮源和碳源产酶,最适产酶温度为25℃．在此基础上进行正交实验分析得到了该菌株的最佳发酵条件为：蛋白胨和淀粉含量各为1．33％,酵母膏含量为0．3％,温度为25℃．     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

刺参肠道微生物组成分析及产酶、溶血性试验

对野生和人工养殖刺参的肠壁及内容物中的菌群数量、种类组成进行了研究;并结合产酶试验和溶血性试验,对刺参肠道益生菌做了初步的体外筛选。结果表明,野生刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(3.30±0.41)×107 cfu/g、(6.39±0.32)×107 cfu/g,养殖刺参肠壁及内容物中的细菌数量分别为(2.83±0.31)×107 cfu/g、(5.67±0.53)×107 cfu/g。野生刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)和希瓦氏菌属(Shewanella);养殖刺参肠道优势菌为弧菌属(Vibrio),次优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)。在224株细菌中,共有160株细菌具有产酶能力,所占比例为71.43%,其中具产蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶能力菌株分别为114株、114株、108株,所占比例分别为50.89%、50.89%、48.21%。99株细菌中有23株具有溶血性,所占比例为23.23%。综合分析实验数据,确定6株细菌作为刺参肠道潜在益生菌,菌株代号分别为HS1(Pseudomonas)、HS5(Bacillus)、HS7(Shewanella)、HS8(Vibrio)、HS10(Vibrio)、HS11(Vibrio)。     

琼胶降解菌F-6筛选、培养条件及对条斑紫菜(Porphyra yezoensis)细胞解离作用的研究

利用琼胶作为唯一的碳源从青岛太平角海域的海水和红藻样品中筛选分离得到一株高产琼胶酶的海洋菌F-6,对其最适的产酶条件,利用琼胶酶分离条斑紫菜的原生质体和原生质体的培养进行研究。结果表明,通过单次单因子和正交实验确定琼胶降解菌株F-6最适产酶培养基配方为(W/V):琼胶0.7%;酵母粉0.3%;蛋白胨0.5%;NaCl2.0%;K2HPO40.1%;CaCl20.02%;MgSO4·7H2O0.05%;FeSO4·7H2O0.002%;起始pH=7.5,最适的发酵产酶条件为:26℃培养36h。经条件优化后,粗酶液的酶活高达631.6U/ml。发酵液经过6000g离心30min得到粗酶液,粗酶液经过8k分离膜超滤,加入1mol/L渗透剂,0.22μm滤膜过滤除菌后降解条斑紫菜组织块,成功地分离得到大量的紫菜原生质体,其产率为3×106个原生质体/g新鲜紫菜组织。原生质体经初步培养发育成愈伤组织,其成活率为60%。     

富含古罗糖醛酸的褐藻多糖生产菌株的构建

为获得古罗糖醛酸(Guluronate)含量高的细菌胞外褐藻多糖,利用PCR从海洋细菌Pseudomonassp.QDA中克隆了其甘露糖醛酸C-5差向异构酶基因(algG),连接入质粒pMF 54Km,构建了重组表达载体pMF54 Km-algG。利用三亲接合法将pMF54 Km-algG转入菌株QDA中,获得algG过量表达重组菌株QDA-G1。H-NMR测定结果表明,QDA-G所产的褐藻多糖中β-D-甘露糖醛酸(M)与它的C-5差向异构体α-L-古罗糖醛酸(G)的比值为0.38,G的质量分数达到74.2%,比野生菌株QDA提高了26.4%。且重组菌株遗传稳定性良好,连续传代20代后,M/G的比值无明显变化。