RAPD标记在大连湾牡蛎种群研究中的应用

对四个不同地点（莱州,荣成,青岛和日照）的大连湾牡蛎（Ｃｒａｓｏｓｔｒｅａｔａｌｉｅｎｗｈａｎｅｎｓｉｓ）进行了ＲＡＰＤ分析,结果表明相邻两地种群的遗传距离不明显。地理相距越远,遗传距离越大。莱州种群中具有ＯＰＫ１１—６８５标记,日照种群具有ＯＰＫ１１—７８０标记。上述两地之间的青岛和荣成种群中,６２．５％的个体同时具有这两个标记;只有２０％的个体为ＯＰＫ—７８０标记。莱州和日照种群间的基因流动有一定的局限性,而位于这两地之间的种群存在明显的基因流动现象     

日本盘鲍×皱纹盘鲍子代杂种优势的RAPD分析

本文通过对日本盘鲍 (D)、皱纹盘鲍 (H)及其二者的正反杂交子代 D♀× H♂ (DH)、D♂× H♀ (HD)四样本的基因组 DNA进行 RAPD标记分析。探讨了杂种优势产生的分子遗传机制。从 4 0个随机引物 (OPK,OPV系列 )中筛选出 12个引物进行扩增 ,共得到 113条清晰稳定的扩增带 ,多态率占 4 3.3%。其中四群体各有其特异扩增位点。另外 D与 DH,H与 HD及 D与 DH,HD等间亦存在共享片段。四群体内相似性指数各自为 0 .798(H)、0 .799(D)、0 .777(HD)、0 .788(DH)。可见正反杂交子代群体内相似性指数皆低于两亲本 ,这表明杂种子代基因组发生的变异更大些。皱纹盘鲍与其正反杂交子代的相对遗传距离分别为 0 .0 76 ,0 .0 95,而日本盘鲍与其正反杂交子代的相对遗传距离分别为 0 .0 31,0 .0 33,前者明显大于后者 ,这表明杂交子代与两亲本的遗传距离不是对等的 ,而是更偏向日本盘鲍。     

原生动物单细胞PCR应用初探——以天蓝喇叭虫为例

以天蓝喇叭虫(Stentor coeruleus)为研究对象,探索了单细胞单基因PCR扩增及单细胞全基因组PCR扩增技术在原生动物中的应用.经过不断探索和优化条件后,试验取得了理想的结果.在40例单细胞单基因(SSU rDNA基因全序列)PCR的一次性扩增中,新鲜细胞和经过中性红染色的细胞都获得了100%的成功率,室温下酒精(95%)保存一周的细胞获得了82.5%的成功率.在单细胞全基因组PCR扩增中,采用高效高保真的phi29 DNA聚合酶结合随机引物(Random Primer)进行扩增,获得了丰富且质量较高的PCR产物.以全基因组扩增产物(稀释10倍)对四个常用的基因位点(TEF1、SSU rRNA、18S-ITS1-5.8S、a-tubulin)进行扩增,均成功获得相应的基因片断.     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条检测简单异尖线虫/派氏异尖线虫方法的建立

简单异尖线虫复合种(Anisakissimplexspeciescomplex)是人兽共患寄生虫,其中的简单异尖线虫(A. simplex sensu stricto)和派氏异尖线虫(A. pegreffii)能引起人异尖线虫病。本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)结合流动试纸条(lateralflowdipstick,LFD)建立了简单异尖线虫/派氏异尖线虫的快检技术。本研究以简单异尖线虫核糖体DNA的内转录间隔区(ribosomal internal transcribed spacer 2, rDNA-ITS2)序列为检测靶标,设计6条特异性的引物进行(荧光)LAMP反应。将生物素化的LAMP产物与异硫氰酸荧光素标记的探针杂交并通过LFD可视化显示。结果表明,本研究建立的LAMP-LFD可以特异性检测出简单异尖线虫/派氏异尖线虫,而对其它10种蠕虫的检测结果呈阴性;针对两个异尖线虫姊妹种的第三期幼虫(third-stagelarvae,L3)的检测灵敏度为单条虫体基因组DNA的10–5倍。优化后的LAMP反应时间为40min,加之探针杂交和LFD显色,整个检测时程只需50min。利用本LAMP-LFD方法对2015—2017年收集于140尾海鱼的1573条线虫进行检测的结果表明,简单异尖线虫/派氏异尖线虫是东海海域的优势种,这与经rDNA-ITS1-5.8S-ITS2测序的结果一致。因此, LAMP-LFD方法能快速、灵敏且准确地检测简单异尖线虫/派氏异尖线,在经济鱼类中简单异尖线虫复合种的筛检和常规检验检疫具有巨大潜力。     

基于LAMP-LFD技术的有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)快检方法

以东海原甲藻的ITS序列(Internal transcribed spacer,ITS)为检测靶标,将生物素标记的环介导恒温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)扩增产物与经异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针特异性杂交,并结合横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)肉眼直接观察检测结果,建立了有害赤潮藻东海原甲藻(Prorocentrum donghaiense)的快速检测技术。经优化后的最适条件为63°C、30min,较常规PCR扩增缩短约2h。结果表明:LAMPLFD可特异性检出东海原甲藻,对常见赤潮藻检测结果均为阴性;其对东海原甲藻基因组DNA的检测最低限为47pg/μL,是常规PCR技术(以F3/B3为引物)的10倍。LAMP-LFD技术能高效、特异地检出东海原甲藻,仪器设备依赖性低,结果可视化,有望成为赤潮原因种检测监控的常规方法。     

哈维氏弧菌可视化LAMP快速检测方法的建立及应用

【目的】为加强对哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）的早期快速诊断和筛查,探究一种快速检测方法。【方法】以哈维氏弧菌外膜通道蛋白基因Toic为靶基因,以钙黄绿素为检测结果指示剂,通过对反应体系、反应时间和温度进行优化,并检测其特异性和灵敏度,建立一种针对哈维氏弧菌的可视化环介导等温基因扩增（LAMP）检测方法。【结果】该方法的检测时间最快为35 min,灵敏度为100 fg/mL,特异性强,与8种弧菌及金黄色葡萄球菌均无交叉反应。实用性检测结果显示,该方法可准确并特异性地检测到鱼体组织中感染的哈维氏弧菌。【结论】建立一种设备简单、操作简单、反应快速、特异性强、灵敏度高、结果可视化的哈维氏弧菌LAMP快速检测方法,且适用于石斑鱼（Epinephelus）感染哈维氏弧菌的早期快速诊断,为进一步推广该技术在石斑鱼及其他水生动物哈维氏弧菌感染监测中的现场大规模应用提供技术支撑。     

环介导恒温扩增技术快速检测米氏凯伦藻方法的建立

米氏凯伦藻(Karenia mikimotoi,Hansen)属于裸甲藻目(Gymnodiniales),裸甲藻科(Gymnodi-niaceae),凯伦藻属(Karenia)。它能产生溶血性(hemolytic)毒素和鱼毒(ichthyotoxins),溶解鱼类细胞,破坏鱼鳃组织结构,使鱼类无法正常呼吸而窒息死亡[1]。近年来,米氏凯伦藻引起的赤潮在世界各海域屡次发生,日本海域,墨西哥湾,新西兰、韩国、苏格兰和澳大利亚海域都有米氏凯伦藻引发赤潮的报道,对渔业造成很大损失[2]。     

对虾白斑症病毒(WSSV)部分克隆片段的序列测定及PCR扩增

对克隆的 WSSV基因组 Xba 1.8kb片段进行序列测定 ,根据所测定的核酸序列 ,通过计算机软件分析 ,设计出一对 PCR引物。所设计的 PCR引物能从纯化 WSSV及患白斑症的对虾组织中扩增出长为 92 1bp的目的 DNA片段 ,并且能检测出 0 .2～ 0 .4μg病虾肌肉组织中的 WSSV。健康对虾、感染MBV的斑节对虾仔虾及 SINPV的扩增结果均为阴性。表明所建立的 WSSV PCR检测法灵敏而且特异。     

长江中华鲟遗传多样性变化

采用随机扩增多态性DNA(RAPD)技术对2000年共30尾长江中华鲟(Acipenser sinensis)幼鲟遗传多样性进行了分析。共用40个10bp长的随机引物,在25个可分析的引物中,只有OPK01,OPK02,OPK03,OPK09和OPK14RAPD-PCR产物有多态现象,多态引物占20%。25个引物共扩增出101条稳定的DNA带。其中12条为多态带,多态座位比例为9.9%。香农遗传多样性指数(H0)为2.6332,遗传多样性指数(H)为0.0261,遗传相似性指数平均为0.9824,遗传距离平均为0.0176。其遗传多样性明显低于葛洲坝截流以前。     

长兴岛刀鲚群体的遗传多样性分析

用随机扩增多态DNA(RAPD)技术对长兴岛刀鲚(Coilia ectenes)38个个体的遗传多样性进行了检测,从40个随机引物中筛选出13个对刀鲚的DNA进行扩增,结果为:13个引物共检测到112条清晰且重复性好的条带,分子质量在200~2000 bp之间,其中多态位点为74个,占66.07%;群体的Shannon多样性指数为0.3164,Nei基因多样性指数为0.2075,结果表明中国刀鲚遗传多样性处于较高水平。刀鲚成熟年龄早,对产卵条件要求不甚严格,产卵率和孵化率都比较高,具有较强的种群恢复能力;另外,由于长江中下游和湖泊刀鲚的捕食者和饵料竞争者的减少,客观上为刀鲚提供了良好的繁殖和幼鱼索饵条件,因此,结合刀鲚自身的生物学特征及生活环境特点,采取合理的保护和管理措施,中国刀鲚资源有望得到恢复。