可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库, 总克隆数为6.09×106CFU, 重组率100%, 平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序, 结果1个空载, 67 个无法对应的基因类型, 已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%, 蚯蚓血红蛋白15.9%, 核糖体蛋白10.6%, 铁结合蛋白8.3%, 肌动蛋白6.1%, 其它基因29.56%。这些基因分别为: 5-氨基乙酰丙酸合成酶、类博莱霉素水解酶、纤溶蛋白、谷氨酰胺合成酶、热休克蛋白、非特性类碱性磷酸酶、脂肪酶、金属蛋白、线粒体、硫氧还蛋白、蛋白磷酸酶、肌钙蛋白C、泛素。根据已获得的可口革囊星虫铁结合蛋白基因, 以EcoRⅠ和KpnⅠ为双酶切位点设计引物, 构建了可口革囊星虫铁结合蛋白真核表达载体pPink-HC-fer, 经PCR 及测序检验, 序列完全正确, 然后电转化至酵母细胞中诱导表达, 经SDS-PAGE检验其融合蛋白分子量大小约为23kDa。     

重组鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球的制备

为考察重组(酵母)鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球的制备工艺和最优处方,并对释药特性进行探讨。以阿拉伯胶、β-环糊精、可溶性淀粉、明胶为壁材,HPMC和卡波姆为生物黏附剂,运用正交试验确定喷雾干燥法制备微球的最佳工艺条件和处方。结果表明,微球的最佳制备工艺和处方为β-环糊精与阿拉伯胶以15∶1、HPMC与CP以4∶1配比为理想壁材,喷雾干燥进风温度160℃、进料速度10mL·min-1、雾化压力0.5MPa、壁材浓度15%、芯材比1∶3为最佳组合,所得微球能达到缓释12h的试验设计要求。本法工艺稳定、可行,所得鲑鱼降钙素结肠黏附缓释微球具有良好的缓释效果。     

别藻蓝蛋白基因在毕赤酵母(Pichia pastoris)中的表达

采用亚克隆方法,将别藻蓝蛋白(allophycocyanin,APC)基因插入到毕赤酵母整合型表达载体pPIC6αA中,再用SacⅠ线性化,纯化后,用氯化锂法转化毕赤酵母菌株X-33,筛选表达APC的重组子。PCR和序列分析表明,APC基因已整合到酵母染色体中。重组子经甲醇诱导,用Western blotting在培养基上清液检测到APC,表明别藻蓝蛋白(APC)在毕赤酵母中可以表达。APC由两种亚基组成,分子量分别为19kDa和21kDa。重组子经摇瓶培养48h表达量达4.4mg/L。     

酵母双杂交系统的应用及发展前景

酵母双杂交系统有利于检测蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA和蛋白质与小分子之间的相互作用,因而对分子调控体系的研究起巨大的反 作用。文中系叙述了基于Ga14系统的双杂交技术的应用及其局限性,还介绍了单杂交系统、 双杂交系统、三杂交系统以及Sos恢复系统(SRS)。与其它领域一样,酵母双杂交系统将会在 海洋分子生物学研究中取得成功。     

应用酵母双杂交系统筛选虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白

FOXL2是脊椎动物的雌性决定基因,在多种无脊椎动物中也被认为是雌性决定与分化的关键基因,但其在无脊椎动物中的作用机制目前尚不清晰。本文利用Clontech酵母双杂交系统筛查虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白。研究首先构建诱饵质粒pGBKT7-FOXL2,并检测诱饵蛋白的毒性及自激活活性,结果显示诱饵蛋白对酵母菌株无毒,也无自激活活性。利用该诱饵质粒,本研究从虾夷扇贝酵母双杂交cDNA文库筛选得到17个阳性克隆,测序验证得到12个读码框正确的阳性克隆,它们来自4种蛋白:COP9信号复合体亚基5、钠/钾ATP酶β3、哺乳动物室管膜相关蛋白1和胰脂肪酶相关蛋白2。研究进一步将诱饵质粒与4种蛋白的猎物质粒进行共转化验证,结果均为阳性,表明这4种蛋白与虾夷扇贝FOXL2都可能存在相互作用。本文为研究FOXL2在无脊椎动物性别决定与分化中的作用提供了参考。     

马氏珠母贝α2-巨球蛋白受体结合区酵母双杂交系统的构建及自激活检测

【目的】构建马氏珠母贝(Pinctada martensii)酵母双杂交文库及α2-巨球蛋白受体结合区诱饵载体,检测其在酵母细胞中的自激活作用。【方法】利用CLONTECH SMART技术及酵母体内同源重组的方法构建马氏珠母贝酵母双杂交cDNA文库;将α2-巨球蛋白受体结合区克隆至pGADT7载体,并转化AH109酵母感受态细胞,检测自激活作用。【结果与结论】酵母双杂交文库容量为1.11×107克隆/mL,重组率大于90%;菌落PCR结果显示,插入片段长度均在500bp以上;诱饵质粒成功转化至AH109菌株,且无自激活性,符合文库构建指标,可用于文库筛选。     

酵母双杂交系统用于WSSV结构蛋白VP39相互作用的宿主蛋白基因的初步研究

为研究WSSV的结构蛋白VP39相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。将构建好的VP39基因的重组载体pGBKT7-VP39转化酵母Y187后,与含文库质粒的酵母株AH109融合,在营养缺陷培养基上进行反复筛选,得到1个阳性克隆,测序并进行生物信息学分析。结果显示,此cDNA片段在数据库中是新序列,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。本实验成功筛选了VP39相关蛋白的cDNA片段,为进一步研究WSSV的致病机理奠定了基础。     

一株分离于湘江污染水域的酵母(Candida fermentati)的鉴定及其Cd~(2+)的吸附特性

对湘江湘潭段周边污染水域的微生物群落结构进行调查,筛选出一株能够耐受较高浓度镉的野生型酵母样真菌,命名为XTWJX菌株,并对其进行形态学特征、生理试验以及ITS序列和26S rDNA D1/D2区序列分析。结果表明,该菌株属于假丝酵母属的发酵假丝酵母Candida fermentati。金属抗性试验表明,XTWJX菌株对测试的9种不同金属离子显示出较高的抗性能力,尤其是对毒性较大的Cd2+的抗性能力高达6mmol/L,暗示该菌株可能具有应用前景。研究了XTWJX菌株对Cd2+的吸附特性,结果表明,在Cd2+浓度为10mg/L的水溶液中,该菌株对Cd2+显示出有较强的吸附能力。这一结果暗示XTWJX菌株的分离很可能为Cd2+污染的河流和湖泊等水生环境的生物修复提供了一种新型的生物材料。     

皮状丝孢酵母利用大米草水解液发酵生产微生物油脂

研究了产油酵母菌皮状丝孢酵母（Trichosporon cutaneum）利用经过简单脱毒处理的大米草水解液,直接发酵生产微生物油脂。首先分别用1％、2％、4％和6％稀硫酸,在122℃水解大米草,大米草／硫酸（固／液比）为10％。结果表明,在6％的酸浓度下水解40rain后总还原糖含量最高。而1％稀硫酸在140℃下水解大米草,2．8h后,水解液中葡萄糖产量达到最高14．2g／L。然后将该条件下大米草水解液冷冻干燥浓缩为不同的倍数,作为皮状丝孢酵母菌的发酵培养基,水解液浓缩倍数为4．0时,产油量最高达6．0g／L。为高效利用大米草,将大米草开发为一种能源植物,提供了新的途径。