三疣梭子蟹ftz-f1 基因的克隆及相关核受体基因在蜕皮中的功能分析

采用RACE 技术克隆三疣梭子蟹核受体fzt-f1 基因, 全长cDNA 序列1763bp.该基因3'和 5'非编码区分别为1034bp 和141bp, 开放阅读框为588bp, 推测编码195 个氨基酸, 预测分子量为 22.8kDa, 理论等电点为6.35, 命名为PTNHr 基因。同源性和系统进化分析表明, 三疣梭子蟹fzt-f1 基因与刀额新对虾同源性高达75.4%, 并且与刀额新对虾聚为一支。对核受体基因fzt-f1、EcR 和RXR 在蜕皮周期中的表达情况进行实时荧光定量PCR 分析, 结果表明, 三个核受体基因在不同蜕皮时期, 均出现表达差异, 说明这三个基因都参与蜕皮调控过程。其中, fzt-f1 和RXR 基因在不同蜕皮时期的 表达模式上出现相反的表达特征, 预测这两个基因存在相互抑制的调节关系。EcR 和RXR 基因在不 同蜕皮时期的表达模式上出现部分相似的表达特征。     

不同环境因素对三疣梭子蟹“科甬1号”(Portunus trituberculatus)仔蟹蜕壳的影响

为探究三疣梭子蟹"科甬1号"仔蟹最佳蜕壳环境条件,先采用单因素变量实验设计方法,选取温度、盐度、光照时长、p H和底质五种环境因素,分析其对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响。温度组设置17、20、23和26°C,盐度组设置10、15、25和35,光照时长设置0、12和24h光照组,p H组设置6.0、7.5、8.0、8.5和10.0,底质设置有沙和无沙组。实验结果表明,温度组20°C时仔蟹存活率和蜕壳率最高,但蜕壳所需时间最长,26°C时蜕壳起始最早,所需时间最短,但存活率较低;盐度组中,15和25仔蟹存活率和蜕壳率最高;p H组中,7.5、8.0和8.5仔蟹存活率和蜕壳率最高;有沙组仔蟹存活率显著高于无沙组;而光照时长实验组结果差异不显著(P0.05)。综上所述,得到单因素条件下"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度20—23°C、盐度15—25、正常日周期光照、p H 7.5—8.5,有沙环境中。利用正交设计实验方法,研究温度、盐度、底质3个因素对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响,并构建多元线性回归模型。结果得到"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度26°C、盐度25,需要有沙环境,并且拟合得到其日存活率线性回归模型以及日蜕壳率线性回归模型。     

10种金属离子对三疣梭子蟹中肠腺消化酶活性的影响

以酶学分析方法研究了10种金属离子(Ag 、Cd2 、Ca2 、Cu2 、Fe3 、Hg2 、Mg2 、Mn2 、Pb2 和Zn2 )对三疣梭子蟹Portunus trituberculatus中肠腺蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A、羧肽酶B、淀粉酶和纤维素酶活性的影响,10种金属离子浓度分别设置为5×10-4、1×10-3和5×10-3mol.L?13个梯度。结果表明,在实验浓度范围内低浓度(0.5mmol.L-1)Fe3 、Pb2 、Mn2 及0.5和1mmol.L-1的Ca2 对蛋白酶活性影响不显著,Mg2 对蛋白酶的激活作用随浓度的升高而升高,1mmol.L-1的Mn2 对蛋白酶表现为显著激活作用;3种浓度的Ca2 、Cd2 、Mg2 、Mn2 对胰蛋白酶均表现显著激活作用;Ca2 及低浓度的Mg2 和Cu2 对胰凝乳蛋白酶有激活作用;Hg2 及低浓度的Mg2 、Mn2 、Zn2 对羧肽酶A有激活作用;Ca2 及低浓度的Mg2 对羧肽酶B有激活作用;Ca2 、Cd2 、Mn2 和低浓度的Zn2 、Fe3 、Pb2 对淀粉酶表现为激活作用;Zn2 、Fe3 、Mn2 、Cu2 对纤维素酶表现为激活作用。除此之外,金属离子对这几种消化酶均表现为抑制作用,抑制作用随浓度的升高而升高。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)4个野生群体ITS1序列分析及系统进化分析

对我国沿海4个野生群体三疣梭子蟹的核糖体RNA转录单元内间隔区ITS1基因片段进行克隆和测序,获得长度为515—571bp的ITS1核苷酸序列,在4个群体的三疣梭子蟹中共检测到变异位点56个,多态位点比例为9.5%,其中简约信息位点25个,共检测到40种单倍型。通过统计单倍型多态性、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,结果显示:舟山群体多样性指数最高,其次是鸭绿江口群体和海洲湾群体,莱州湾群体最低。在三疣梭子蟹ITS1序列中共发现5种微卫星位点,AMOVA分析结果显示4个群体间的遗传差异显著。另外,将本研究所得序列结合GenBank数据库中十足目12种蟹ITS1序列构建系统进化树,系统树显示同属的不同种各自聚支,与形态学分类吻合。     

三疣梭子蟹PtToll6基因克隆及其在免疫中的功能研究

克隆了三疣梭子蟹TLR家族的一个新基因,将其命名为PtToll6。该基因全长为4 034 bp,预测分子量为109.078 kDa,理论等电点为6.06,共编码977个氨基酸。SMART预测显示, PtToll6具有Toll样受体典型的结构域,包括前端的序列区(LRR)、跨膜区(TM)和胞内(TIR)区,进化树分析表明其与同属节肢动物门的果蝇Dmtoll9聚为一支。组织表达分布结果显示,PtToll6在肝胰腺中特异性地高表达,其次表达于肠道,在鳃中的表达量最低。采用3种PAMPs进行注射刺激,发现PtToll6对脂多糖的响应最为强烈,在感染48 h后的表达量为对照组的上千倍,推测其可能为PtToll6基因主要识别的病原相关分子模式。PtToll6在人工感染副溶血弧菌后的12 h开始上调表达,至24 h达到峰值(上调9.02倍)。采用RNAi敲降PtToll6后, MyD88的表达量相应下调,同时发现感染副溶血弧菌后的死亡率显著提高,为阴性对照组的1.8倍。实验结果表明:PtToll6基因在抗副溶血弧菌中发挥重要功能。本实验对解析三疣梭子蟹抵御病原入侵的分子机制具有重要指导作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌雄性腺的差异转录组分析

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国东海海域具有重要经济价值的蟹类。为探讨雌雄梭子蟹性腺基因表达差异,挖掘与性腺发育相关基因,利用高通量测序技术对三疣梭子蟹雌雄性腺进行测序和生物信息学分析,为进一步研究其性腺发育及性别分化机制提供基础。测序结果经denovo组装共获得192848个转录本,130054个unigene。差异表达分析发现,其中101742个unigene上调,37588个unigene下调。在差异表达数据库中筛选出EcR、RXR、VTG等6个可能参与三疣梭子蟹的性腺分化发育的基因,并利用荧光定量PCR验证其在雌雄性腺中的表达情况,验证结果与转录组测序结果基本一致,为深入研究三疣梭子蟹性腺分化发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。     

三疣梭子蟹幼体中肠腺发育的组织学和细胞学研究

将蚤状幼体 I期 (Z1)到仔蟹共六期三疣梭子蟹幼体固定 ,作横切、纵切和平切的连续切片 ,观察中肠腺的解剖学及组织学特征 ,并研究其细胞的超微结构。三疣梭子蟹的中肠腺起自前、中肠交界处 ,分左右两部分 ,每部分三叶 ,由总管与幽门胃和中肠相通 ,中肠腺管的长度和数量随幼体发育而增加。管壁的上皮细胞在各期幼体均可分为四种类型 :E-细胞 (胚细胞 )、F-细胞 (纤维细胞 )、R-细胞 (吸收细胞 )和 B-细胞 (分泌细胞 ) ,它们在中肠腺管中的分布位置和功能各有不同。     

溶藻弧菌对三疣梭子蟹抗氧化酶系统的影响

从患乳化病的养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体组织内分离出痛原菌--溶藻弧菌(Vibrioalginglyticus),通过肌肉注射的方式对三疣梭子蟹进行感染实验,对照组注射等量的生理盐水,在感染后O、24、48和72 h分别采集不同处理组三疣梭子蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织,测定溶藻弧菌对其各组织抗氧化相关酶活的影响.结果表明:注射生理盐水的对照组三疣梭子蟹体组织中抗氧化酶和MDA含量在不同的采样时间变化不显著(P>0.05).与对照组比较,三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中SOD活性随着感染时间的延长显著降低(P<0.05).在感染溶藻弧菌24 h时血淋巴和肝胰腺组织中GSH-px活性有增强的趋势(P>0.05),随后在感染48 h后GSH-px活性显著降低(P<0.05);感染组各体组织中的MDA含量均随着感染时间的延长而显著上升(P<0.05).结果显示梭子蟹感染溶藻弧菌后机体消除氧化过程自由基的抗氧化酶活降低,脂质过氧化物水平升高,使得抗氧化防御能力下降.     

NaCl 对三疣梭子蟹消化酶活力的影响

作者采用酶学分析方法研究了反应介质中添加NaC1对三疣梭子蟹(Porturrus tritubrculatus)中肠腺蛋白酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、羧肽酶A、羧肽酶B、淀粉酶活力的影响,反应介质中NaC1浓度设置为0、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0和2.0 mol/L 8个梯度.实验结果表明,反应介质中添加NaC1对消化酶活力影响显著,除羧肽酶B外,添加NaC1对三疣梭子蟹消化酶均有激活作用,且所有消化酶都有很高的耐盐性.当反应介质中NaC1浓度为0.1～0.5 mol/L时蛋白酶活力最大;0.5 mol/L时胰蛋白酶活力最大;胰凝乳蛋白酶在反应介质中NaC1浓度为1 mol/L时酶活力最大;羧肽酶A在反应介质中NaC1浓度为0.05～0.1 mol/L时酶活力最大;NaC1对羧肽酶B有抑制作用,在反应介质中NaC1浓度为2 mol/L的条件下,只有未添加NaC1时酶活力的60%;NaC1在0～2 mol/L时对淀粉酶均有激活作用,其最大激活能力在0.5mol/L左右.     

中国沿海三疣梭子蟹的遗传结构和亲缘关系分析

应用CLUSTAL X 1.81对位排序软件和Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) Version 3.1系统发育相关分析软件包,分析了渤海、黄海和东海不同群体的三疣梭子蟹mtDNA D-loop片段序列,(不包括引物)D-loop序列(不包括引物)长约1 241 bp,该片段AT、GC平均含量分别为75.8%和24.2%,AT含量均明显高于GC含量,种群间的遗传距离平均为0.025.依据D-loop序列,应用邻接法(NJ)、最小进化法(ME)及最大简约法(MP),构建中国沿海三疣梭子蟹亲缘关系的系统发生树,MP、NJ和ME树中所显示的三疣梭子蟹亲缘关系基本一致.NJ和ME树中来自东海的XM1与DT5聚为姊妹群;来自渤海的PL1与来自东海的YT1聚为姊妹群;来自东海的DT3与来自黄海的DD1聚为姊妹群,再与来自渤海的PJ1相聚形成一个单系;来自东海的ZS1与来自黄海的QD1聚为姊妹群;来自东海的DT4与来自黄海的YC1相聚,再与来自东海的YT2,YT3相聚.在MP树中,来自黄海的YC1与来自东海的DT4相聚为姊妹群,再与YT2相聚;来自渤海的PL1与来自东海的YT1聚为姊妹群;来自东海的XM1与DT5聚为姊妹群;来自东海的DT3与来自黄海的DD1聚为姊妹群,再与来自渤海的PJ1相聚;来自东海的ZS1与来自黄海的QD1聚为姊妹群;这些群最后再与来自东海的YT3相聚.结果显示中国沿海各海区三疣梭子蟹种群间存在明显的基因交流,亲缘关系的远近并不以海区划分和地理位置的远近为依据.洄游和长期以来跨海区的捕捞作业可能是三疣梭子蟹种群间基因交流的根本原因;蓬勃发展的三疣梭子蟹人工养殖和放流也会导致亲蟹和苗种跨海区交流,对三疣梭子蟹种质资源的保护将产生巨大影响.