基于四种水产病原弧菌的简型芯片检测体系的优化

基因芯片技术在病原菌检测领域展现出良好的前景,本文依托水产病原菌基因检测芯片的检测体系,以水产常见病原弧菌的hsp60、toxR基因检测探针为研究对象,系统研究不同点样液配方、寡核苷酸探针浓度、荧光标记物质浓度、杂交温度、杂交时长对芯片杂交效果的影响,并进行相应优化。结果表明,杂交温度为60℃、杂交时长为2h、探针浓度为1μmol/L、Cy3标记的随机引物的用量为150pmol时,芯片的经济性、灵敏度、检测效率达到均衡;以0.1mol/L磷酸氢二钠和25%二甲基亚砜混合溶液作为点样液,效果较好。优化后的芯片对4种弧菌的检测没有出现交叉杂交现象,探针特异性达到100%;对溶藻弧菌全基因组DNA检测灵敏度为10fg,高出PCR方法约2个数量级。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)铁结合

以克隆获得的可口革囊星虫(Phasolosma esculenta)、枝吻纽虫(Dendrorhynchus zhejiangensis)、泥蚶(Tegillarca granosa)、缢蛏(Sinonovacula constricta)、仿刺参(Apostichopus japonicus)和白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta)6种无脊椎动物的铁结合蛋白基因为基础, 通过NCBI检索下载相应的氨基酸序列, 采用SingalP程序查找信号肽, 用TMHMM程序搜寻预测跨膜区, 采用Clustal W程序多序列比对, 构建进化树。对其编码蛋白的信号肽、跨膜区以及磷酸化位点等进行分析。结果表明, 6种动物的铁结合蛋白都没有信号肽, 也无跨膜区, 不可能是膜上的受体或定位于膜上, 均为胞外蛋白。泥蚶的ferritin有4个磷酸化位点, 仿刺参ferritin有10个, 枝吻纽虫有8个, 白肛海地瓜有9个, 可口革囊星虫和缢蛏的ferritin未搜寻到磷酸化位点。6种铁结合蛋白的疏水性有一定的差异, 最大值在1.0—1.6之间, 最小值在?3.3—?2.8之间。可口革囊星虫和仿刺参的铁结合区域特征序列完全相同, 与文昌鱼、缢蛏、泥蚶、牡蛎、盘鲍有2个氨基酸差异, 与人、小家鼠和叉尾有1个氨基酸差异。     

泥蚶(Tegillarca granosa)生长因子受体结合蛋白2(GRB2)基因的克隆与表达分析

通过已构建的泥蚶(Tegillarca granosa)转录组文库, 利用SMART RACE技术扩增得到泥蚶Tg-GRB2基因的全长cDNA序列, 并对其生物信息学、组织表达及发育阶段表达特征进行了分析。结果表明, 泥蚶Tg-GRB2 cDNA全长1283bp, 开放阅读框为708bp, 编码236个氨基酸; 蛋白结构预测显示, Tg-GRB2蛋白包含SH3-SH2-SH3三个功能域, SH2结构域由两端的α-螺旋和中间反向平行的β-折叠片构成, SH3结构域主要由β-折叠片组成, 具备典型的结构特征; 氨基酸序列比对发现, Tg-GRB2与脊椎动物的同源性为62.1%—63.8%, 而与玻璃海鞘和日本血吸虫同源性较低。qRT-PCR检测结果显示: Tg-GRB2 mRNA在泥蚶血液、斧足、鳃、外套膜、闭壳肌、内脏团6个组织中都有表达, 而在血液中的表达量极显著地高于其它组织; 在泥蚶的不同发育阶段中, Tg-GRB2 mRNA在 2—4细胞胚胎、原肠胚、担轮幼虫、D形幼虫中均有较高的表达量, 而在D形幼虫中表达量最高, 表明Tg-GRB2基因在泥蚶早期发育中发挥重要调节作用。     

虎斑乌贼(Sepia pharaonis)FMRFamide G蛋白偶联受体基因的克隆与表达定位研究

以FMRFamide为典型代表的FMRFamide相关肽,是目前已知的最大的神经肽家族。FMRFamide广泛参与多种生理过程,包括摄食、心跳、渗透平衡、变态、防御和免疫等。采用同源克隆法与RACE技术获得了虎斑乌贼FMRFamide的G蛋白偶联受体基因cDNA全长序列(命名为SpFaGPCR,OL765295),SpFaGPCR cDNA全长1514bp,包括222bp的5''-非编码区(5''-UTR)、35 bp的3''-UTR以及1257bp的开放阅读框(ORF),共编码418个氨基酸。预测相对分子量(MW)为49.8kDa,等电点(pI)为9.76,具有7个跨膜结构域、糖基化位点7个、磷酸化位点36个。同源序列比对分析表明,SpFaGPCR与曼氏无针乌贼的FaGPCR氨基酸序列相似度最高达98%。系统发育分析显示SpFaGPCR与双壳纲的FaGPCR聚为姐妹支。荧光定量结果显示SpFaGPCR在视叶、视腺、脑、缠卵腺中表达量相对较高(P<0.05)。进一步利用原位杂交技术检测到虎斑乌贼视叶的髓质区、视网膜的感光细胞和缠卵腺的瓣叶外层具有明显的阳性杂交信号。实验结果为进一步探讨FMRFamide通过FaGPCR的介导参与虎斑乌贼生理代谢功能奠定了前期基础。     

基于网络药理学探讨莓茶作用于ACE2防治新型冠状病毒肺炎的潜在机制

目的：应用网络药理学方法探究莓茶作用于新型冠状病毒主要受体-血管紧张素转化酶2（ACE2）防治新型冠状病毒肺炎（COVID-19）的作用与机制。方法：在TCMSP数据库中检索出莓茶活性成分,在NCBI Gene等数据库找到疾病相关靶点,在Cytoscape平台筛选出莓茶和疾病的共有靶点,使用STRING和DAVID数据库分析共有靶点的蛋白质相互作用网络、基因本体论（GO）功能和基因组百科全书（KEGG）通路。结果：莓茶-活性成分-靶点-疾病网络含26种活性成分和71个共有靶点。莓茶防治疾病的靶点主要包括白细胞介素6（IL-6）、血管内皮生长因子A（VEGFA）和胱天蛋白酶3（CASP3）等。得到1447个GO条目,主要涉及氧化应激反应、活性氧代谢过程等,得到106条KEGG通路富集结果,主要有晚期糖基化终末化产物及其受体（AGE-RAGE）、缺氧诱导因子1（HIF-1）和磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）-蛋白激酶B（Akt）等信号通路。结论：莓茶可能通过介导AGE-RAGE、HIF-1等多条信号通路,影响ACE2、IL-6、VEGFA等蛋白的表达,调节病毒受体与配体相互作用、氧化应激反应、活性氧代谢等生物功能,故可为防治新型冠状病毒肺炎提供潜在应用价值。     

基于网络药理学预测青皮治疗抑郁症的作用机制

目的：运用网络药理学研究青皮治疗抑郁症的作用机制。方法：采用中药系统药理学分析平台（TCMSP）检索青皮的有效成分及其作用靶点;采用OMIM、GeneCards数据库检索抑郁症的疾病靶点;应用R语言等计算软件获取青皮有效成分的作用靶点和抑郁症疾病靶点的交集基因;运用Perl软件与Cytoscape 3.7.0软件联合构建青皮-有效成分-靶点-抑郁症调控网络;使用STRING构建PPI网络;应用DAVID数据分析软件和Metascape数据库,对所筛选出的“核心基因”进行基因本体（GO）功能和京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路富集分析,最终获得预测结果。结果：通过以上方法,获得青皮的5个有效成分,有效成分的基因靶点与抑郁症基因靶点的交集基因有30个。通过对青皮-有效成分-靶点-抑郁症调控网络的可视化分析,发现有效成分中的川陈皮素（nobiletin）所对应的交集基因最多。运用PPI网络预测到雌激素受体1（ESR1）、胱天蛋白酶3（CASP3）、过氧化物酶体增生激活受体γ（PPARG）等25个基因是青皮治疗抑郁症所干预的重要靶点。GO功能富集分析和KEGG富集分析结果显示,青皮有效成分在分子层面对抑郁症基因的干预有较好的作用。结论：青皮治疗抑郁症的机制主要是作用于ESR1、CASP3、PPARG等25个基因,并在分子层面起到改变抑郁症基因的转录翻译等作用。     

溶藻弧菌dtd基因的克隆及原核表达条件优化

根据NCBI数据库中已发表的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)全基因组序列合成一对特异性引物,应用聚合酶链式反应(PCR技术)扩增溶藻弧菌HY9001菌株dtd基因,将其定向克隆到原核表达载体pET-32a构建重组表达质粒pET-DTD,并对其进行诱导温度、诱导时间、诱导IPTG浓度等条件的优化,最后探究其纯化时最佳咪唑洗脱浓度。结果表明:DTD蛋白成功表达,且其以包涵体的形式存在,在诱导温度37℃、IPTG浓度0.1 mmol/L条件下诱导5 h表达量最高,纯化最佳咪唑洗脱浓度为150 mmol/L。     

汝城地名探源

汝城县地处湖南省东南隅,素有“鸡鸣三省,水注三江”之称,境内文物占迹林立,国家、省级非物质文化遗产保护项目众多,人文历史极为厚重。汝城县是中国行政区划和地名学会、联合国地名专家组命名的“千年古县”,也是中国古祠堂之乡,湖南省历史文化名城;汝城县还是中国农耕文明的发祥地之一,相传中华民族的人文祖先炎帝神农氏作耒耜于汝城耒山。     

仿刺参养殖区泥样中灿烂弧菌拮抗菌的快速筛选及其保护作用

采用不同培养基和泥样加热方法,从红岛仿刺参养殖区泥样中分离出27株可培养细菌,对其进行16SrRNA基因序列分析。发现海泥中可培养细菌多分布于γ-变形菌纲(γ-proteobacteria)(占总菌数的71.4%),其中包括假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、弧菌属(Vibrio)和希瓦氏菌属(Shewanella)等;80℃加热处理20min,海泥中可培养细菌多属于芽孢杆菌属(Bacillus)。人工浸泡感染实验发现,泥样中灿烂弧菌LJ08(Vibrio splendidus)对仿刺参幼参具有致病性。泥样中分离获得的可培养细菌经安全性、抑菌活性和毒性检测,筛选出对灿烂弧菌LJ08有明显抑菌作用的LJ03、LJ04和LJ06并用其进行人工拮抗实验。统计分析显示,添加LJ03和LJ06拮抗组的累计排脏率分别为(36.11±4.81)%和(2.78±4.81)%,与仅添加灿烂弧菌LJ08的阳性对照组差异显著(P0.05)。结果表明,LJ03和LJ06具有很好保护仿刺参幼参的作用,尤其LJ06对仿刺参幼参的排脏保护率达104.7%。作为拮抗灿烂弧菌的潜在有益菌,LJ06在仿刺参养殖中将有良好的应用前景。     

溶藻弧菌acfA基因克隆与生物信息学分析

溶藻弧菌引起海水养殖产业弧菌病的主要病原,附着定植因子基因acfA是溶藻弧菌重要毒力基因之一,其表达产物是溶藻弧菌有效定植在宿主肠道上所必需的蛋白。根据弧菌属细菌acfA基因基因保守区设计引物,采用Touchdown PCR扩增acfA基因部分序列,Inverse PCR和Nested PCR扩增已知序列侧翼序列,成功克隆了溶藻弧菌acfA基因全长。克隆的acfA基因序列全长为743 bp,开放阅读框长度为648 bp组成,共编码215个氨基酸,在5′端上游未发现-35区和-10区序列。演绎的ACFA蛋白N端有18个氨基酸信号肽序列,表明该蛋白是分泌型蛋白;蛋白结构分析表明主要由α螺旋和不规则卷曲构成。BLAST分析表明,该蛋白氨基酸序列与其他弧菌相应蛋白同源性较高,是较保守的外膜蛋白。