长江、黄河、辽河水系中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)野生和养殖群体遗传变异的微卫星分析*

我国中华绒螯蟹(以下简称河蟹)养殖主要集中在长江、黄河和辽河流域, 经过多年的人工养殖、跨流域引种和增殖放流等活动可能会对其遗传特性造成一定的影响,因此本研究利用29个微卫星标记对3个水系的野生和养殖群体进行了遗传特征分析。结果表明：(1) 29个SSR标记共检测到943个等位基因,各位点等位基因数在11-52之间, 平均为32.52个; 各位点的平均观测和期望杂合度分别为0.723和0.876,仅5个位点处于Hardy-Weinberg平衡中;各位点平均多态信息含量(PIC)为0.864,其中28个为高多态性位点(PIC>0.5)。(2) 6个群体均表现出较高的遗传杂合度水平(H_O=0.702-0.744);香农信息指数(I,介于2.566-2.661)显示6群体的遗传多样性水平依次为：长江野生>长江养殖>黄河野生>辽河养殖>黄河养殖>辽河野生。(3)方差分析(AMOVA)结果显示,来源于种群内个体间和个体内部的变异分别为14.02%和85.88%,群体遗传分化指数F_ST仅为0.0008-0.0050,群体间的遗传分化处于较低水平(F_ST<0.05);基于Nei’s遗传距离的UPGMA聚类结果显示,长江野生群体单独聚为一支, 其余5群体共同聚为大一支, 其中长江养殖群体、黄河野生群体与黄河养殖群体聚为一小支,辽河野生群体和养殖群体聚为另一小支。(4) 瓶颈效应分析显示,所有群体近期均经历过有效种群的降低。群体遗传结构分析显示显示,6种群内个体的遗传组成混杂,不能根据其遗传结构划分出最佳理论群体数。综上所述,三水系野生和养殖群体均具有较高的遗传多样性,长江和黄河野生群体的遗传多样性略高于养殖群体;三水系河蟹野生群体的遗传分化与地理距离具有一定的相关性,长江养殖群体、黄河野生及养殖群体间的遗传分化较小可能与其跨流域引种及养殖群体逃逸造成其种质混杂有关。     

许氏平鲉微卫星标记与体长、体质量、体高的相关性分析

为了解许氏平鲉(Sebastes schlegelii)微卫星标记与生长性状的相关性,选取26个微卫星标记在海捕许氏平鲉群体中进行微卫星筛选,每个微卫星位点的等位基因数(Na)在3~21,有效等位基因数(Ne)为1.1815~15.5676;观测杂合度(Ho)范围为0.0417~0.9999;期望杂合度(He)范围为0.1581~0.9456;多态信息含量(PIC)范围为0.1509~0.9320。利用单标记分析法分析了多态性较高(PIC0.5)的22个标记与体长、体质量、体高的相关性,结果显示3个标记与生长性状显著相关,其中HJ2-32与体长、体质量和体高显著相关(P0.05),并推断等位基因D与C对于体质量、体长、体高分别具有重要的正向与负向影响;HJ7-2与体质量显著相关;HJ7-22与体长显著相关,并推测等位基因F对体长具有正向影响,等位基因B对体长有负面影响。这些标记可为许氏平鲉分子标记辅助育种提供基础。     

剑尾鱼微卫星DNA的筛选

以剑尾鱼(Xiphophorus helleri)为材料，经Mbo I限制性内切酶消化基因组DNA后，选取500～2000bp的片段连接到经BamH I酶切的pUC18载体上，转化大肠杆菌DH5α构建部分基因组文库。采用设计合成的(AC)7、(GT)7重复序列为引物，PCR筛选部分基因组文库，对其中9个重组阳性克隆进行测序，结果共获得24个微卫星序列，其中Perfect(完美型)13个，占54．2％；Imperfect(非完美型)3个，占12．5％；Compound(混合型)8个，占33．3％。表明(AC／GT)n在剑尾鱼的基因组DNA中含量非常丰富。同时，根据其中3个克隆微卫星的侧翼序列设计引物，PCR扩增剑尾鱼基因组DNA，结果均扩增到目的片段。而且，这3对引物扩增出来的微卫星片段在非选育的剑尾鱼中显示出多态性．而在近交系19代则表现为单态，为剑尾鱼的实验动物化遗传研究提供了理论依据。     

中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)基因组微卫星特征分析

对中国对虾基因组随机测序，获得了总长度约为641000个碱基的基因组DNA序列，从中找到1362个重复序列。其中，两碱基重复类型的重复数目最多(985个)，占重复序列总数目的72．32％；其次是三碱基(149个)和四碱基(102个)，分别占重复序列总数目的10．94％和7．49％。另外，六碱基重复34个，单碱基重复50个，五碱基重复5个，分别占重复序列总数目的2．50％、3．67％、0．37％。在单碱基重复类型中，重复拷贝类别为A的重复数目最多；两碱基重复类型中，AT重复数目最多，其次是AC和AG；三碱基重复类型中以AAT重复拷贝类别最多．其次是AAG和ATC；四碱基重复类型中，AGAT重复数目最多；五碱基重复类型只发现了AGAGA、GAGGC、TCTYC和TTTCT四种重复拷贝类别；六碱基重复中以ATTATC重复数目最多。其中一些序列已经提交GeneBank注册，注册号为AY545898-AY545913。中国对虾基因组二碱基重复类型中以不完全(Imperfect)形式的微卫星序列为主，其中GC重复拷贝类别的重复数目很少。利用8对微卫星引物对60个个体遗传多样性分析，共获得了60个等位基因，因此认为微卫星技术在中国对虾基因组研究中具有较好的应用前景。     

日本鳗鲡(Anguilla japonica)和欧洲鳗鲡(A. anguilla)的微卫星差异

采用PCR扩增单位点微卫星的方法研究了日本鳗鲡(Anguilla japonica)和欧洲鳗鲡(A. anguilla)的遗传差异.结果表明,微卫星等位基因数目分布范围为8-26,35组被试(5个分类单元各7个位点)的显著性检验的结果表明其杂合性显著缺乏(P＜0.01),日本鳗鲡的4个亚种群的所有微卫星位点均偏离哈-温平衡,对日本鳗鲡种群分化进行的正合检验结果也否定了种内个体随机分布的假设.FST值为0.0098(P=0.00048)揭示了日本鳗鲡亚种群内存在较弱但显著的遗传分化.各分类单元间的FST及RST逐一对应矩阵显示了日本鳗鲡与欧洲鳗鲡两个远缘种之间存在显著差异.计算Goldstein的遗传距离并由此推算出两个种的分化时间约为200多万年.     

条斑紫菜(Porphyra yezoensis)dbEST中筛选微卫星位点及引物种间转移扩增

采用电子查询的方法，借助Blast软件从条斑紫菜表达序列标签数据库的20979条序列中筛选微卫星位点，共发现非冗余微卫星位点211个，占整个条斑紫菜EST数据库的1．01％。其中双碱基重复微卫星位点共有35个，占查找微卫星序列总数的16．6％；三碱基微卫星有176个，占83．4％。双碱基重复微卫星中AG／CT形式最多，而三碱基中GGC／GCC最多。从筛选出的微卫星位点中选取序列设计合成引物，用在坛紫菜上进行引物种间转移扩增研究。在总共15对引物中有13对引物在两个种间都有扩增产物。结果表明，微卫星位点在这两种紫菜之间具有很高的同源性。获得的微卫星引物可用来进行种群遗传多样性研究、谱系鉴定和遗传图谱的构建。而微卫星标记的共显性可用来进行紫菜二倍体丝状体纯合性检验，为纯系紫菜品系的鉴定提供分子生物学鉴定方法。     

坛紫菜微卫星DNA序列的筛选

自坛紫菜(Porphyrahaitanensis)丝状体中提取的DNA,经Sau3AI限制性内切酶消化后,将300~900bp之间的DNA片段回收,并连接到经BamHI酶切并去磷酸化的pUC18载体上,最后转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中,构建坛紫菜小片段DNA质粒文库。选用pUC18质粒的通用引物进行PCR反应,对文库进一步筛选并检测插入片段的大小,在384个阳性克隆中,有278个含有大小合适的插入片段。经测序及序列分析,在103个克隆中获得172个微卫星序列,其中完美型107个,占62.2%,非完美型53个,占30.8%。(GC)n与(CG)n在坛紫菜DNA中非常丰富,分别占25%及17%,但重复频率相对较低。     

基于微卫星标记的花鲈亲子鉴定技术

【目的】推进家系选育工作,构建准确、高效、经济的亲子鉴定技术,以准确获得花鲈（Lateolabrax maculatus）的系谱信息。【方法】选择8对有多态性的微卫星标记。应用微卫星荧光标记多重PCR和毛细管电泳检测技术,建立1组多重PCR反应体系。用软件GeneMarker和Cervus软件分析实验结果。【结果与结论】8个微卫星位点的平均等位基因数为10.125个,平均期望杂合度为0.657,平均观测杂合度为0.680。双亲未知时单亲累积排除概率（CE-1P）为97.21%,双亲之一已知时单亲累积排除概率（CE-2P）为99.74%。双亲未知时双亲对累积排除概率（CE-PP）为100.00%。174个子代和34个候选亲本的实际亲子鉴定结果显示,170个子代的似然率对数值均大于0。当置信度大于95%时,有143个子代均能匹配到父母本,实际鉴定率为82.18%。     

马氏珠母贝(Pinctada martensii)2个地理群体杂交子代的杂种优势和遗传变异

采用马氏珠母贝的印度群体(II0)和三亚群体(SS0)的2×2双列式杂交获得了4组子代,II1(II0♀×II0♂)、IS1(II0♀×SS0♂)、SI1(SS0♀×II0♂)和SS1(SS0♀×SS0♂);分析表明,杂交组子代IS1和SI1在壳高、壳长、绞合线长、壳宽、壳重上都表现出杂种优势;IS1在壳宽指数上表现出杂种优势,而在总重和壳重指数上未表现杂种优势;SI1在总重和壳宽指数上表现出杂种优势,而在壳重指数上未表现杂种优势;SI1在壳高、壳长、绞合线长和壳重上的杂种优势较IS1高,差异极显著(P0.01),而IS1在壳宽上的杂种优势较SI1高,差异极显著(P0.01)。应用6个微卫星位点分析4个组合子代的平均FST值为0.357,表明4个组合子代间有较大的遗传差异和较高的分化水平;平均等位基因数依次为SI1(6.17)IS1(6.00)II1(5.00)SS1(4.67),等位基因丰度依次为SI1(5.34)IS1(5.04)II1(4.47)SS1(4.55),期望杂合度(He)依次为IS1(0.55)SI1(0.54)SS1(0.44)II1(0.42),观察杂合度(Ho)依次为SI1(0.52)IS1(0.46)SS1(0.35)II1(0.29),杂交子代的杂合度和遗传多样性高于自繁子代,杂交增加了杂交子代的杂合度和遗传多样性,杂种优势与杂合度和遗传多样性增加直接相关;综合考虑杂种优势与遗传变异的结果,确定三亚野生群体♀×印度养殖群体♂杂交组合作为"珍珠贝育种规划POBs"的主要育种方式。     

萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)与其他5种罗非鱼遗传多样性比较研究

根据已知罗非鱼相关基因序列设计了5对微卫星引物,对萨罗罗非鱼、尼罗罗非鱼、以色列红罗非鱼、台湾红罗非鱼、奥利亚罗非鱼和齐氏罗非鱼6种罗非鱼进行遗传多样性分析,结果表明:(1)6种罗非鱼在5个微卫星座位上共发现22个等位基因和49种基因型,萨罗罗非鱼、台湾红罗非鱼及齐氏罗非鱼的等位基因数和基因型数较少,萨罗罗非鱼特有的等位基因是190和204,特有的基因型为190/190、204/204、270/223和270/243;(2)与另外5种罗非鱼相比,萨罗罗非鱼的有效等位基因数(Ne)、平均杂合度期望值(He)和多态信息含量值(PIC)都较低,分别为1.812、0.331和0.326;(3)6种罗非鱼明显分为2支,萨罗罗非鱼单独为一支,另外5种罗非鱼聚为一支;(4)萨罗罗非鱼保种的主要问题是要特别防止近亲繁殖。