红笛鲷弧菌病血清流行病学研究方法的建立

以红笛鲷Lutjanus sanguineus弧菌病的主要病原菌——溶藻弧菌Vibrio alginolyticus为抗原制备兔抗血清,以辣根过氧化酶标记的羊抗兔血清为酶标二抗,建立了酶联免疫吸附试验检测技术。通过棋盘滴定法测定,得出溶藻弧菌菌悬液的最佳工作浓度为5×108mL-1,兔抗溶藻弧菌血清的最佳稀释度为1∶16000,酶标羊抗兔抗体的最佳稀释度为1∶2000。应用本实验建立的间接双抗体夹心法对红笛鲷进行现场检测,患病红笛鲷特异性抗体的检出率为70%,外观健康红笛鲷的检出率为20%。结果表明,本实验所建立的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法可以用于红笛鲷弧菌病的血清流行病学研究,而且可以检测出隐性感染状态下的红笛鲷。     

淋巴囊肿病毒mcp基因变异特征及其基因型分析

淋巴囊肿病毒是引起多种海、淡水鱼淋巴囊肿病的病原,且不同淋巴囊肿病毒分离株间存在一定的差异。本文对25株淋巴囊肿病毒分离株mcp基因的变异特征进行分析,结果表明:分离自同一宿主的淋巴囊肿病毒mcp基因序列并非完全一致,有些同宿主分离株间存在着较少的变异,其MCP蛋白序列间的变异位点多位于不规则结构域、属于非蛋白相互作用位点;分属不同基因型淋巴囊肿病毒分离株MCP蛋白序列间的变异位点也多位于不规则结构域,变异位点为蛋白相互作用位点的比率仅占21.98%。金头鲷淋巴囊肿病毒分离株LCDV-sa是一种新的淋巴囊肿病毒基因型,此25株淋巴囊肿病毒可分为7个基因型。对淋巴囊肿病毒变异的研究,可加深对其感染机制的认识,有助于了解其传播途径,可为淋巴囊肿病的防控提供重要的理论依据。     

淋巴囊肿病毒中国分离株基因组序列和结构分析

LCDV-cn是分离自中国养殖牙鲆的淋巴囊肿病病原,给中国牙鲆养殖业带来了严重危害。通过PCR、克隆和测序,获得了LCDV-cn部分基因的序列,证明LCDV-cn与LCDV-C的基因组序列是一致的。比较基因组学分析发现,LCDV-cn基因组中有137个ORF是其独有的、与LCDV-1及其它虹彩病毒无同源区域。对LCDV-cn基因组进行生物信息学分析发现,在LCDV-cn独有的ORF中,有的编码与宿主同源的蛋白,有的编码与DNA复制相关的蛋白,某些ORF编码的蛋白含有跨膜区等。LCDV-cn的独有基因或许对其毒力和宿主范围有关。     

注射氟苯尼考对红笛鲷免疫指标的影响

以0、5、10、20 mg.kg-1的氟苯尼考腹腔注射红笛鲷,研究氟苯尼考在国家规定的使用范围内对红笛鲷血清部分免疫指标的影响。结果显示:5 mg.kg-1组氟苯尼考对所测的各项指标无影响或影响不显著;10 mg.kg-1组中氟苯尼考对红笛鲷血清SOD活力、AKP活力有显著性提高(P<0.05),对溶菌酶的含量、IgM的含量无显著性影响;20 mg.kg-1组中红笛鲷血清碱性磷酸酶AKP、超氧化物歧化酶SOD活力、溶菌酶、抗体IgM均受到显著性抑制(P<0.05),但影响持续时间不同,这表明高浓度氟苯尼考显著抑制红笛鲷各项免疫指标,从而影响到鱼体自身的免疫功能。     

鱼类致病杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)特异性PCR检测方法的建立

鱼类诺卡氏菌病是全球性的鱼病,杀鲑诺卡氏菌(Nocardia salmonicida)是引起鱼类诺卡氏菌病的主要病原之一。根据杀鲑诺卡氏菌16S-23S转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立特异性PCR检测杀鲑诺卡氏菌的方法。结果表明,筛选的PCR引物可特异性地扩增出杀鲑诺卡氏菌的ITS片段,检测灵敏度(DNA浓度)为28.3 pg·μL-1。检测人工感染杀鲑诺卡氏菌的鱼组织,结果显示,该方法可从未分离到病原菌的病鱼组织中检出阳性片段,较传统细菌分离鉴定方法更为高效灵敏。     

红笛鲷tdt基因融合蛋白原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)末端脱氧核糖核酸转移酶TdT蛋白(Terminal deoxynucleotidyl transferases)成熟肽基因序列,并与pET-32a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-32a-TdT,再将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。运用传统方法优化诱导条件,以提高重组融合蛋白的表达效率。SDS-PAGE分析表明,37℃、0.7 mmol/L IPTG条件下诱导4 h后,TdT融合蛋白的表达量最大,分子质量大小与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式存在。利用HisTrap HP亲和层析柱使TdT蛋白得到进一步纯化,最佳咪唑洗脱浓度为300 mmol/L,Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性的结合,表明表达蛋白为目的蛋白。     

环境16S rDNA和16S rcDNA序列分析湖光岩玛珥湖的浮游细菌组成

通过提取环境总16S rDNA和总16S rRNA分别构建DNA克隆文库和反转录cDNA文库,并进行克隆测序和序列分析,探讨湖光岩玛珥湖浮游细菌和浮游活性细菌的遗传多样性。结果表明:构建两个水层的4个克隆文库,即1 m和10 m水层总菌的16S rDNA文库和总活性菌的16S rcDNA文库,共获得413条序列,分属15门、32目、52科;1 m水层的rDNA文库与rcDNA文库中Verrucomicrobia类群所占比例最大(36.8%和32.1%),其次为Alphaproteobacteri(a 15.1%和16%)和Betaproteobacteri(a 17.9%和16%);在10 m水层的2个文库中,Alphaproteobacteria类群均占绝对优势,分别为63.5%(rDNA)和43.8%(rcDNA),其次为Verrucomicrobia(11.5%和14.3%),其他细菌类群包括Acidobacteria、Chloroflexi、Firmicutes、待定门OD1、Planctomycetes、Spirochetes和Deltaproteobacteria,比例在0.8%~3.8%之间;在科的水平上,SAR11为湖光岩玛珥湖最为丰富的类群,占总克隆数的26.9%,其中在10 m水层的比例高达51.5%。序列同源性分析表明,绝大多数序列(89.8%)来源于新种,其中19.6%的序列可能来自于新属,69%的序列可能来自于全新的科。湖光岩玛珥湖浮游细菌群落结构较为独特,有大量的浮游细菌种类尚未获得相应的纯培养物,蕴含着丰富而新颖的微生物资源。     

草鱼NEDD4结合蛋白基因1原核表达条件的优化及纯化

通过PCR方法克隆草鱼(Ctenopharyngodon idellus)NEDD4结合蛋白基因1(简称CiN4BP1)的开放阅读框(ORF)序列,将扩增产物与pET-32a(+)表达载体相连接,构建原核表达载体pET-N4BP1,对重组质粒进行酶切和测序鉴定,然后将其导入大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,检测该蛋白表达情况。SDS-PAGE分析表明,在温度为37℃,IPTG浓度为0.06 mmol/L,诱导时间为4 h时,N4BP1重组融合蛋白的表达量最高,蛋白分子质量为40.2 ku,与软件预测值大小相符,该蛋白主要以包涵体形式表达。利用His Trap HP亲和柱纯化目的蛋白;Western blot分析表明,N4BP1融合蛋白能与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性反应,说明该表达的蛋白为目的蛋白。     

溶藻弧菌免疫胶体金快速检测试纸条的制备

采用溶藻弧菌ATCC17749菌体作为抗原免疫新西兰大白兔,制备兔抗溶藻弧菌多克隆抗体;利用柠檬酸钠还原氯金酸法制备胶体金及胶体金-抗体结合物,并将其喷涂在玻璃纤维膜上冷冻干燥;在硝酸纤维素膜上包被兔抗溶藻弧菌多克隆抗体和羊抗兔IgG分别作为检测线和控制线;将处理后的玻璃纤维素膜、硝酸纤维膜、样品垫及吸水纸组装成双抗夹心试纸条,并对试纸条灵敏度、特异性、稳定性进行评价。结果表明,制备的兔抗溶藻弧菌多克隆抗体的效价可达1∶512 000;胶体金溶胶的最佳制备条件为:加入1.8 mL 10 mg/mL的柠檬酸三钠,500 W微波炉中火加热10 min;试纸条检测线和质控线的抗体最佳包被量分别为8.0 mg/mL和1.0 mg/mL;试纸条检测灵敏度为1×106cfu/mL,特异性试验显示,试纸条与哈氏弧菌、副溶血弧菌、霍乱弧菌、拟态弧菌、美人鱼弧菌、弗氏弧菌、河流弧菌、创伤弧菌等8株菌无交叉反应;稳定性试验表明,试纸在4℃干燥条件下能稳定保存5个月以上。制备的溶藻弧菌多克隆检测试纸条可灵敏、较特异地检测源自病鱼的溶藻弧菌,整个检测过程可在10 min内完成,适用于溶藻弧菌的快速检测。     

恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学

在水温26±2℃、盐度28条件下,恩诺沙星(enrofloxacin,EF)按5 mg/kg的剂量腹腔注射和口灌红笛鲷(Lutjanus sanguineus),用反相高效液相色谱法研究恩诺沙星在红笛鲷体内的药代动力学和组织分布。结果显示:注射和口灌后红笛鲷血浆的药时数据均符合一级吸收二室模型;血药达峰时间(tp)分别为0.75和1.5 h,血药质量浓度峰值(cmax)分别为5.22和3.94μg/mL,药时曲线下面积(AUC)分别36.98和17.24 mg/(L.h),消除半衰期(t1/2β)分别为13.28和9.18 h;恩诺沙星在组织中分布较广,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的cmax分别为3.53和3.40μg/g、4.08和3.98μg/g、11.23和5.40μg/g,tp分别为1.5和2.0 h、1.0和2.0 h、0.75和1.5 h,AUC分别33.17和23.12 mg/(L.h)、39.36和18.20 mg/(L.h)、98.97和56.69 mg/(L.h);EF在红笛鲷体内消除速度较慢,注射和灌服给药肌肉、肝脏和肾脏的t1/2β分别为22.08和83.32 h、41.52和94.47 h、20.94和21.81 h。表明恩诺沙星注射给药在红笛鲷体内的吸收和消除均快于口灌给药。