河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)是水产养殖中致病性较强的一种条件致病菌,为更灵敏、高效地对其进行检测,研发出一种基于核酸适配体竞争置换作用的检测方法。首先设计并制备出磁珠-核酸适配体-荧光报告探针的检测复合物(MAP检测复合物),然后利用溶藻弧菌与其核酸适配体有较好的亲和特异性,在对样品进行检测时,样品中的溶藻弧菌就会竞争MAP检测复合物中的核酸适配体,从而置换出与该核酸适配体结合的荧光报告探针,再通过检测置换出的报告探针的荧光强度来表征溶藻弧菌的浓度,从而实现对溶藻弧菌的定量检测。结果表明,该方法对溶藻弧菌的检测限可达到1CFU/mL,与嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟钝爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)、哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、大肠杆菌(Escherichia coli)等水产养殖中的常见致病微生物没有交叉反应,并在1~20、20~100和100~1000 CFU/mL范围内都表现出较好的线性关系。另外还对MAP检测复合物的制备条件进行了优化,较为理想的制备条件为:100nmol/L核酸适配体与100nmol/L荧光报告探针按体积比1︰1混合结合30 min,制备出50 nmol/L的核酸适配体-荧光报告探针复合物,然后该复合物再与25μg/mL的磁珠按体积比1︰1混合结合60 min,制备出相应的MAP检测复合物。利用核酸适配体的竞争置换作用检测溶藻弧菌有较好的灵敏度和特异性,展现了较好的应用前景。     

哈维氏弧菌生物被膜体外模型的建立及成膜特性研究

采用改良微孔板法建立哈维氏弧菌Vibrio harveyi TS-628菌株生物被膜体外模型,并进一步研究环境因子对哈维氏弧菌体外形成生物被膜的影响。结果发现,哈维氏弧菌TS-628菌株可以在聚苯乙烯板中形成生物被膜,并且该菌生物被膜的形成受起始菌液浓度、温度、pH等理化因子的显著影响。温度为30℃、NaCl质量分数为3%—6%、pH为7、孵育时间为36h是哈维氏弧菌形成生物被膜的最佳条件。此外哈维氏弧菌在分别经表皮黏液、鳃黏液、肠道黏液、肝脏提取液、脾脏提取液、肌肉提取液包被的基质上成膜效果显著,其中在经肝脏提取液包被的基质上形成的生物被膜量显著高于在其他生物基质上形成的生物被膜量(p<0.01)。     

病原性副溶血弧菌在天然海水中的饥饿耐受研究

将副溶血弧菌培养至对数生长期,用天然海水洗脱,调整菌浓度至107个/cm3左右后置于27℃恒温培养箱进行饥饿试验.结果表明:饥饿初期细菌总数、可培养菌数和活菌数都有较大幅度上升;饥饿中、后期,总菌数与活菌数缓慢下降,而可培养菌数下降速度较快.饥饿前副溶血弧菌呈短杆状,染色均匀;饥饿后许多细胞中央出现染色较浅的区域,细胞形态变为椭圆形.副溶血弧菌对大黄鱼表皮黏液的黏附量随着饥饿时间延长而急剧下降,饥饿7 d后的黏附量接近于空白.用SDS-PAGE分析不同饥饿时期菌体蛋白质的差异,结果表明:饥饿30 d后菌体蛋白条带比饥饿前的蛋白质条带少;饥饿60 d后菌体蛋白质条带比饥饿30 d时的多,但比饥饿前少.研究结果对于揭示副溶血弧菌的流行病学特征有重要的参考价值.     

大黄鱼病原菌——溶藻弧菌的EuSA快速检测研究

以灭活溶藻弧菌(0.05%甲醛,30℃,8h)制成菌苗,注射免疫实验兔获得抗血清.该抗血清经吸附后与副溶血弧菌、河流弧菌等10株对照菌株无交叉反应.用该抗血清进行溶藻弧菌ELISA检测,其最低检测极限为97000cfu/ml.将该方法应用于养殖现场,检测结果为海水中溶藻弧菌浓度均低于最低检测限、外观健康大黄鱼肝脏中溶藻弧菌的阳性检出率为20%、患病大黄鱼的阳性检出率为80%,表明ELISA法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

东山九孔鲍细菌性疾病研究

本文分离纯化了1999年春东山县患病九孔鲍的2株主要病原菌，进行了回归感染、药敏试验、病变组织的超薄切片观察。结果表明此次暴发性流行鲍病的致病菌主要是溶藻弧菌和副溶血弧菌。在所进行的48种药物的药敏试验中，2株菌仅对氯霉素和复方新诺明等8种药物共同敏感，药物联合抗菌试验还表明复方新诺明与磺胺甲基异恶唑等有协同作用，氯霉素与复方新诺明等有加成作用。     

大黄鱼溶藻弧菌LPS的间接ELISA检测

用酚 水法从20dm3溶藻弧菌培养液中分离得到脂多糖(LPS)97.6mg,以0.5mg cm3的LPS溶液通过耳缘静脉注射免疫实验兔,经过3次加强注射后从颈动脉放血制备抗血清.该抗血清的效价为1∶2560,对副溶血弧菌等10株细菌的交叉反应效价都较低.用免疫吸附过滤法去除血清中的非特异性成分.用吸附后的抗血清进行溶藻弧菌间接ELISA检测,其检测限为97×104个 cm3.以ELISA进行大黄鱼体内溶藻弧菌检测.结果表明:用LPS抗血清可以较为灵敏地检测大黄鱼体内的溶藻弧菌,该方法不仅可以用于诊断大黄鱼的溶藻弧菌病,也可以检测无病症带菌大黄鱼.     

河流弧菌(Vibrio fluvialis)感染后牙鲆(Paralichthys olivaceus)血清抗菌物质的研究

采用1×107cells/ml的河流弧菌悬液背部肌肉注射感染牙鲆,注射后24h、48h试验组的血清抗菌活力分别极显著性(P0.01)和显著性(P0.05)高于对照组。用Sephadex G-25凝胶柱对第二次人工注射感染后24h牙鲆血清进行分离,其中第7—15收集管对河流弧菌具有抗菌活性,对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等指示菌也具有明显的抗菌作用,在4—100℃范围内,大部分活性分离组分随着温度的升高其抗菌活力有所增强。具有抗河流弧菌活性收集管(第9管)经弱阳离子交换柱分离后,OD280显示出2个蛋白吸收峰,具有抗河流弧菌活性的物质主要集中在第1吸收峰。SDS-PAGE分析显示经Sephadex G-25凝胶柱和弱阳离子交换柱分离的抗菌蛋白分子量较大。以上结果表明,牙鲆被河流弧菌感染后能很快产生大量抗菌物质释放到血清中;主要抗菌物质的分子量较大,且热稳定性较好;这些活性物质的抗菌活性具有较强的特异性。     

斑节对虾病原菌胞外产物的致病性研究

由养殖濒死病虾体内分离的副溶血弧菌(2019#)、溶藻弧菌(4302#)和嗜水气单胞菌(1003#)培养液中分别提取了胞外产物,测定了酶成分,定量分析了蛋白酶及磷酸酯酶的活性.用细菌胞外产物粗提液对斑节对虾进行致死试验,戊二醛固定致死对虾的肝组织,电镜观察了斑节对虾肝组织的超微病变,初步探讨了三株细菌胞外产物诱发虾病的病理.     

网箱养殖青石斑鱼河流弧菌病研究

随着养殖规模的扩大 ,病害问题日益严重 ,严重地制约着石斑鱼养殖业健康发展。刘秀珍等１９９４年报道创伤弧菌是石斑鱼的病害弧菌病的病原。本文作者对１９９９年夏季厦门市同安区琼头村网箱养殖石斑鱼的严重病害进行了研究 ,试图能为养殖青石斑鱼（Ｅｐｉｎｅｐｈｅｌｕｓａｗｏａｒａ）的病害防治提供理论依据。１材料与方法１．１试验用鱼患病石斑鱼取自同安区琼头村养殖网箱 (体重９７～２４５ｇ) ;健康石斑鱼购自厦门火烧屿养殖网箱 (体重８１～１１４ｇ) ,暂养备用。１．２病原菌的分离将病鱼体表清洗消毒后 ,用无菌操作方法从肝脏、…