草鱼(Ctenopharyngodon idellus)呼肠孤病毒(GCRV)VP6相互作用蛋白的筛选

为筛选与草鱼呼肠孤病毒GCRV096 VP6发生相互作用的宿主蛋白,先将VP6基因的PCR扩增产物,克隆至酵母表达载体p GBKT7以构建其诱饵质粒(p GBKT7-VP6);再将酵母菌Y2HGold(含p GBKT7-VP6)与酵母菌Y187[含草鱼肾脏细胞(CIK)c DNA文库质粒]进行人工诱导融合,然后经选择培养筛选阳性克隆。结果共筛选到4株阳性克隆,经测序、生物信息学分析,分别属于两条不同的核苷酸序列,其中之一所编码的产物与GAPDH(3-磷酸甘油醛脱氢酶)同源性较高。可见,该酶极可能在GCRV096侵染宿主的初期发挥着重要作用。     

南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化

采用RT-PCR技术克隆南极衣藻GR基因ORF全长cDNA,然后经酶切、连接等步骤构建其原核表达载体;并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行了优化,以期获得较大量的酶蛋白。结果表明,将构建的原核表达载体pET-GR导入大肠杆菌BL21,可以高效表达融合蛋白;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在;经SDS-PAGE电泳...     

苯酚对奥尼罗非鱼非特异性免疫指标的影响

采用水体中常见污染物——苯酚对奥尼罗非鱼进行刺激,研究不同浓度苯酚对奥尼罗非鱼非特异性免疫功能的影响。奥尼罗非鱼分别暴露于0.005、0.025、0.125、0.625、3.125 mg/L等5个浓度的苯酚中8周,每两周采集抗凝血液和血清,用于检测非特异性免疫指标。结果表明:暴露于低浓度苯酚组(0.005 mg/L和0.025 mg/L)的奥尼罗非鱼NBT(氯化硝基四氮唑蓝)阳性细胞数等非特异性免疫指标相对于对照组无显著性差异(P>0.05),中浓度苯酚组(0.125 mg/L和0.625 mg/L)和高浓度苯酚组(3.125mg/L)对罗非鱼非特异性免疫指标的影响存在显著的时间效应和剂量效应(P<0.05),可减少NBT阳性细胞数、抑制超氧化物歧化酶活力和抗菌活力;促使溶菌酶活力和溶菌酶含量先升后降。表明中高浓度苯酚组对奥尼罗非鱼具有明显的免疫毒性。     

利用有益微生物改善养殖生态环境的研究

研究了噬菌蛭弧菌在实验室条件下对水产养殖中常见病菌的裂解能力及噬蛭弧菌的光合细菌对池塘生态环境的改善作用。结果表明，噬菌蛭菌对嗜水气单胞菌具有裂解作用，噬菌蛭弧菌和光合细菌结合使用对养殖环境具有明显的改善作用。25d实验组比对照组池塘中的细菌总数少2个数量级，70d后实验组比对照组池塘中的细菌总数少3个数量级，25d对照组COD为6．35mg/L，使用噬菌蛭 菌浓度为3，5，10mL/m^3及光合细菌皆为5mL/m^3实验组的COD分别为4．67，4．16，4．18mg/L；25d后对照组NH3－N为0．49mg/L，使用噬菌蛭弧菌浓度为3，5,10mL.m^3及光合细菌皆为5mL/m^3实验组的NH3－N分别为0．36，0．33，0．32mg/L，90d后对照组NH3－N为0．41mg/L，使用噬菌蛭弧菌浓度为3，5，10mL/m^3，及光合细菌皆为5mL/m^3实验组的NH3－N分别为0．27，0．22，0．21mg/L,55d后对照组硫化的为0．011mg/L，使用噬菌蛭弧菌浓度为3，5，10mL/m^3及光合细菌皆为5mL/m^3实验组的硫化物分别为0．010，0．008，0．008mg/L。     

利用有益微生物改善养殖生态环境的研究

研究了噬菌蛭弧菌在实验室条件下对水产养殖中常见病菌的裂解能力及噬菌蛭弧菌和光合细菌对池塘生态环境的改善作用。结果表明 ,噬菌蛭菌对嗜水气单胞菌具有裂解作用 ,噬菌蛭弧菌和光合细菌结合使用对养殖环境具有明显的改善作用。 2 5d后实验组比对照组池塘中的细菌总数少 2个数量级 ,70d后实验组比对照组池塘中的细菌总数少 3个数量级 ;2 5d后对照组COD为 6 35mg L ,使用噬菌蛭弧菌浓度为 3、5、1 0mL m3 及光合细菌皆为 5mL m3 实验组的COD分别为 4 6 7、4 1 6、4 1 8mg L ;2 5d后对照组NH3 N为 0 4 9mg L ,使用噬菌蛭弧菌浓度为 3、5、1 0mL m3 及光合细菌皆为 5mL m3 实验组的NH3 N分别为 0 36、0 33、0 32mg L ,90d后对照组NH3 N为 0 4 1mg L ,使用噬菌蛭弧菌浓度为 3、5、1 0mL m3 及光合细菌皆为 5mL m3 实验组的NH3 N分别为 0 2 7、0 2 2、0 2 1mg L ;5 5d后对照组硫化物为0 0 1 1mg L ,使用噬菌蛭弧菌浓度为 3、5、1 0mL m3 及光合细菌皆为 5mL m3 实验组的硫化物分别为0 0 1 0、0 0 0 8、0 0 0 8mg L。     

溶藻弧菌HY9901血红素结合蛋白HutB的原核表达及纯化

为探究溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)HY9901血红素结合蛋白HutB作为疫苗候选抗原的可能性,采用PCR方法扩增V.alginolyticus HY9901 hutB基因全长序列,克隆到pMD18-T载体,经双酶切、连接后,定向插入到pET-28a(+)中,构建原核表达载体pET-HutB,转入大肠杆菌BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达。SDS-PAGE验证后,优化诱导表达条件和纯化条件,并进行Western-blot分析。结果表明,HutB蛋白在E.coli中诱导表达的最优条件:0.4 mmol/L IPTG,37℃诱导4h,表达的蛋白分子量与预期大小相符,主要以包涵体的形式存在,300 mmol/L咪唑洗脱时效果最佳,能与鼠抗His-tag单抗特异性结合。     

草鱼白细胞介素6基因克隆与表达分析

白细胞介素6(IL-6)是一个多效的细胞因子,在机体免疫应答、急性期反应以及造血调控等过程中发挥着重要作用。以草鱼(Ctenopharyngodon idella)为研究对象,采用RT-PCR和Smart RACE技术克隆获得草鱼IL-6(CiIL-6)cDNA序列,CiIL-6的cDNA全长为1 145 bp,包含一个长为702 bp的开放阅读框,能编码233个氨基酸,预测CiIL-6的蛋白质分子质量为26.74 ku,等电点为8.72。其中5'和3'非编码区(UTR)分别为86 bp和357bp。氨基酸同源性分析显示,草鱼和斑马鱼(Danio rerio)的亲缘关系最近,它们的CiIL-6氨基酸同源性高达76%,而与其他物种的同源性均低于30%。RT-PCR的结果显示,CiIL-6在健康草鱼的胸腺、头肾和脾脏表达最高,而在鳃、胃和心脏中的表达量最低。     

红笛鲷重组激活基因rag1原核表达条件的优化及纯化

克隆编码红笛鲷(Lutjanus sanguineus)RAG1蛋白(recombination activating protein1)活性核心区的基因序列,并与pET-28a(+)载体连接,构建原核表达载体pET-28a-RAG1,将其转入大肠杆菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG进行诱导表达。为提高融合蛋白的表达效率,运用传统的实验方法对诱导条件进行优化。SDS-PAGE分析表明,在37℃条件下,利用0.1 mmol/L IPTG诱导8 h后,RAG1重组融合蛋白的表达量最大,相对分子质量与预测值相符,该蛋白主要以包涵体形式高效表达,利用His Trap HP亲和柱使其得到进一步纯化;Western blot分析显示,该融合蛋白可与鼠抗His-tag单克隆抗体发生特异性结合,说明表达蛋白为目的蛋白。     

利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

一株海水氨氧化细菌的系统发育分析

应用PCR技术扩增16S rRNA基因和amoA(ammonia monooxygenase subunit A)的基因片段,并测定其序列,对一株源于海水养殖水体的高效氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)进行了系统发育分析。结果表明,经PCR扩增得到了1 098 bp的16S rRNA基因片段和491 bp的amoA基因片段,将其序列用NCBI-Blast软件在GenBank数据库中进行同源性检索后发现,该菌株的16S rRNA基因序列和amoA基因序列分别与亚硝化单胞菌Nitrosomonas sp.NS20的相对应基因片段相似性分别为98.4%和96.7%。在此基础上构建了系统发育树,表明用该菌株的16S rRNA基因片段和amoA基因片段构建的系统发育树均与亚硝化单胞菌属类聚在一起,结合该菌株形态和生理生化特性,鉴定该株氨氧化细菌属亚硝化单胞菌。