白肛海地瓜(Acaudina leucoprocta) 精氨酸激酶的基因克隆与表达

精氨酸激酶是调节能量代谢的重要酶类,在无脊椎动物体内能量平衡过程中起重要作用。利用PCR扩增技术,从白肛海地瓜的cDNA文库中克隆得到精氨酸激酶(arginine kinase)基因,其全长为2139bp,包括5′非翻译区(5’-UTR)序列92bp,3′端非翻译区(3’-UTR)序列934bp和1113bp的ORF,编码371个氨基酸,预测分子量大小和等电点分别为42.32kDa和7.19。构建了精氨酸激酶原核表达质粒并转化表达菌株,经IPTG诱导表达后,获得了与预期的分子量大小一致的表达产物。利用该目的蛋白制备了白肛海地瓜精氨酸激酶的特异性多克隆抗体,经Western blot证明该蛋白为精氨酸激酶。     

基于纳米免疫磁珠快速富集4 种海洋致病性弧菌的研究

为研究海洋中常见致病性弧菌的快速分离富集方法--免疫磁珠法, 本文以副溶血弧菌、 哈维氏弧菌、创伤弧菌、灿烂弧菌为研究对象, 制备纳米免疫磁珠, 并通过一系列优化条件, 用3M 试纸计算捕获率来确定免疫磁珠最佳捕获条件。最后分别对4 种致病性弧菌的不同菌液稀释浓度、 对1 株目标菌和8 株非目标菌、4 种混合菌进行捕获, 从而评价免疫磁珠的灵敏度、特异性以及抗干 扰能力。结果表明, 4 种磁珠偶联最佳抗体量为300、600、150、150μg.最佳捕获条件: 副溶血弧菌 免疫磁珠用量3mg, 免疫反应45min, 磁分离3min, pH 7.4 缓冲液体系。哈维氏弧菌免疫磁珠用量3mg, 免疫反应45min, 磁分离1min, pH 6.0 缓冲液体系。创伤弧菌免疫磁珠用量12mg, 免疫反应60min, 磁分离5min, pH 8.0 缓冲液体系。灿烂弧菌免疫磁珠用量6mg, 免疫反应30min, 磁分离3min, pH 7.4 缓冲液体系。在纯培养情况下, 4 种免疫磁珠灵敏度均达到10 CFU/mL 数量级; 分别对9 株菌进行捕 获, 对目标菌的捕获率均达到87%以上, 对非目标菌的捕获率均低于32%; 对4 种混合菌进行捕获时, 免疫磁珠捕获率不受其它杂菌干扰。本研究证明了该免疫磁珠有较好的灵敏度、特异性和抗干扰能 力, 且与其它增菌方法相比, 大大缩短了时间, 具有较好的应用前景。     

宁波沿海陆源排污口细菌结构多样性和铁代谢相关的毒力基因的研究

应用多重PCR技术对肠杆菌铁代谢相关毒力基因fhuA、irp2、sltA和sodB进行同步检测, 研究宁波沿海陆源排污口人畜共患致病菌群落结构在人类活动影响下的分布差异及对环境因子变化的响应趋势。通过16S rRNA 基因的PCR扩增和限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)分析技术, 研究了东海重要陆源排污口的细菌群落多样性; 建立肠杆菌铁载体外膜受体蛋白fhuA、铁调节蛋白irp2、类志贺样毒素sltA、含铁超氧物歧化酶sodB基因多重PCR体系, 并用该体系检测铁代谢相关毒力基因在陆源排污口的分布情况。2011年3、5、8、10月份, 在宁波沿海陆源排污口中共分离纯化1000余株、98种细菌, 16S rRNA 基因序列分析表明, 它们分属于4个门5个纲13个科21个属, 其中?-变形杆菌纲(67株, 68.4%)和芽孢杆菌纲(16株, 16.3%)分别为变形菌门、厚壁菌门中主要纲。98株细菌中, fhuA+irp2+sodB+基因型检出率为35.71%; fhuA+irp2+ sltA+的基因型检出率为25.27%; irp2的基因型检出率为13.19%; fhuA基因型检出率为12.09%; fhuA+ irp2+ 基因型检出率为9.89%; sltA+sodB+基因型检出率为8.79%; fhuA+irp2+sodB+sltA+基因型检出率为8.79%。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)重组铁蛋白富集Pb2+等重金属特性和功能研究

利用可口革囊星虫重组铁蛋白富集Pb²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺和Zn²⁺等8 种重金属离子后, 通过透射显微镜和傅里叶红外光谱测定蛋白的超微结构变化和内部基团特性。以 天然的马脾铁蛋白为对照, 观察重组铁蛋白与天然铁蛋白的差别。结果显示, 重组铁蛋白富集Pb²⁺ 和其它7 种重金属离子后蛋白体积大小与重金属离子种类直接相关。重组铁蛋白相对天然铁蛋白来 说在富集不同种类重金属离子后, 除了非特异性酰胺特征峰和蛋白特征峰外, 还出现一些专门富集 某些重金属离子的特异基团, 如:-CH₃、-CH₂-、-CH-、-NH-、-SO₃-、-COOH、-S=S-和-C-S-C 等。 通过细胞实验进一步验证了铁结合蛋白能够通过富集重金属离子Pb²⁺来保护小鼠成骨前体细胞 MRC3T3-E1, 使细胞的死亡率明显降低(P<0.05).     

宁波沿海陆源排污口蓝藻(Cyanobacteria)和裸藻纲(Euglenoidea)生物的分布特点

采用高通量454焦磷酸测序方法对宁波沿海2个重点排污口、8个一般排污口的20个站位水样进行分析,得到2011年的3月、5月、8月和10月份各排污口蓝藻和含叶绿体单细胞生物的分布情况。研究结果表明:宁波沿海陆源排污口中含叶绿体单细胞生物数量最多,占91.857%,包括眼虫门(Euglenozoa)、绿藻门(Chlorophyta)、隐藻门(Cryptophyta)生物。其中主要为眼虫门的裸藻纲(Euglenoidea)生物占90.08%。蓝藻门的集球藻目(Synechococcophycideae)和颤藻亚目(Oscillatoriophycideae)含量相对较多,分别占5.70%和1.79%;排污口中裸藻纲生物数量季节性差异比较大,3月份、8月份数量相对较多,5月份和10月份较少,推测这类生物的数量与季节性温度变化有关;各排污口污染物、这两类生物检出量和种类有一定差异,在氮磷含量高的排污口(如S9号)其检出量并不高,推测检出量与排污口的主要污染物中氨氮含量没有直接关系,可能受氮磷比的影响。     

宁波沿海陆源排污口拟杆菌(Bacteroidetes)分布的特点

采用高通量454焦磷酸测序方法对宁波沿海2个重点排污口、8个一般排污口的20个站位水样进行分析,得到2011年3月、5月、8月、10月份各排污口总体微生物以及拟杆菌纲的分布情况。通过对454测序结果分析,共成功鉴定24个门,主要包括变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和后壁菌门(Firmicutes)等。其中拟杆菌门的变化趋势与梭杆菌门(Fusobacteria)相似,均为随月份的增加而递增的趋势。在拟杆菌门下,共鉴定出3个纲3个目9个科27个属,4个采样月份大部分站点的优势属为黄杆菌纲(Flavobacteria),其次为拟杆菌纲(Bacteroidetes)、鞘脂杆菌纲(Sphingobacteria),通过聚类分析发现,拟杆菌门分布规律主要与排污口类型和季节有一定的关系。通过454测序检测到了极难培养的寡营养细菌鞘脂杆菌,也说明了454测序较传统微生物生态学研究方法的优势,同时针对普雷沃菌属(Prevotella sp.)及黄杆菌属(Flavobacterium sp.)两种具有代表性的属的分布情况进行了分析。     

攀枝花大田铀矿床成矿地质特征及控矿因素

大田铀矿床位于扬子陆块西缘康滇地轴中段,矿区内出露地层为古元古界康定群咱里组,矿体主要产于咱里组一、二段碎裂的混合岩化斜长角闪岩、含黑云母混合岩中。混合岩化斜长角闪岩型矿石w(SiO_2)54.50%～57.13%,w(Na_2O)2.07%～5.68%;含黑云母混合岩型矿石w(SiO_2)67.31%～85.24%,w(Na_2O)1.45%～4.31%,显示成矿作用伴有硅质增加和钠质交代作用。矿石稀土元素配分型式为右倾型,δEu为0.17～0.46,指示铀成矿与深熔作用晚期结晶分异形成的熔融体有关。铀矿体的形成和分布受韧—脆性构造系统、钠质交代蚀变、不同岩性结构面、含碳(石墨)层位、变质深熔作用等因素控制。电子探针数据显示,区内铀矿物主要为晶质铀矿(UO_2:81.93%～86.96%)、钛铀矿(UO_2:52.49%～62.41%,TiO_2:16.91%～23.52%),显示高温成矿作用特点。矿床成因类型为与构造有关的变质热液矿床。     

缢蛏(Sinonovacula constricta)重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白的性质解析

利用缢蛏(Sinonovacula constricta)重组铁蛋白富集Fe~(3+)和Mn~(2+)制备重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白,通过扫描电镜、X射线能量色散能谱仪(EDS)和MALDI TOF/TOF质谱系统测定蛋白的表面形貌变化、金属元素的能量变化和肽段分子量。利用综合物性测量系统(PPMS)测定蛋白纳米颗粒在室温300K,外加磁场3T下的磁学性质变化。结果显示,重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白与空白相比,表面形貌发生明显变化,Fe-铁蛋白仍为小球状,Mn-铁蛋白聚集体呈片层花球状,Cd-铁蛋白聚集体呈小圆球状,Mn-铁蛋白富集Cd~(2+)后呈片层花瓣散落状。Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白分别检测出相应金属元素且都有其特征能量态。两种重组蛋白的肽谱图与空白组相比,除铁蛋白保守肽段外还出现各自的特征肽段,推测与铁蛋白对Fe~(3+)和Mn~(2+)的富集功能密切相关。Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白纳米颗粒磁滞回线形状与铁蛋白空白组基本相同,呈顺磁性特征,磁性强度随Fe~(3+)和Mn~(2+)富集量的增加而增大。通过比较Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白与空白组在富集Hg~(2+)、As O43–和Cd~(2+)三种重金属离子方面能力的差异,发现Fe-铁蛋白对Hg~(2+)、AsO_4~(3–)和Cd~(2+)三种重金属的富集能力是空白组的2.4倍、1.7倍和3.7倍。Mn-铁蛋白对Hg~(2+)、AsO_4~(3–)和Cd~(2+)三种重金属离子在相同条件下的富集能力也有明显提高,分别为铁蛋白空白组的1.8倍、3.0倍和4.6倍。本研究结果为Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白在重金属污染治理方面的应用提供了数据参考。     

南移养殖的刺参(Apostichopus japonicus)cDNA文库的构建及原肌球蛋白基因的研究

以南移养殖的刺参为实验材料,采用非均一化的Oliga-dT引物定向克隆技术构建了南移刺参混合组织的cDNA文库。对文库质量的分析结果表明,cDNA文库的库容量为2.2×107cfu,重组率达95.8%,平均插入片段长度750bp左右。挑取cDNA克隆进行5’端测序,成功测序185个反应,分析得到136个单基因簇(Unigene),其中包括40个重叠群(Contigs)、96个单拷贝EST(Singletons)。结果表明,克隆南移养殖的刺参原肌球蛋白(tropomyosin,Trp)cDNA全长序列为1112bp,ORF编码284个氨基酸,其预测蛋白的分子量为33.27kDa,等电点为4.56。该氨基酸序列与紫石海胆、南极大磷虾、锯缘青蟹、文昌鱼、河蟹、家蚕同源性分别为62%、51%、46%、49%、47%、46%。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)酵母双杂交文库和铁结合蛋白真核表达载体的构建

构建了可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)的酵母双杂文库, 总克隆数为6.09×106CFU, 重组率100%, 平均插入片段长度>1kb。随机挑取200个克隆子测序, 结果1个空载, 67 个无法对应的基因类型, 已知的132个基因中线粒体蛋白占29.54%, 蚯蚓血红蛋白15.9%, 核糖体蛋白10.6%, 铁结合蛋白8.3%, 肌动蛋白6.1%, 其它基因29.56%。这些基因分别为: 5-氨基乙酰丙酸合成酶、类博莱霉素水解酶、纤溶蛋白、谷氨酰胺合成酶、热休克蛋白、非特性类碱性磷酸酶、脂肪酶、金属蛋白、线粒体、硫氧还蛋白、蛋白磷酸酶、肌钙蛋白C、泛素。根据已获得的可口革囊星虫铁结合蛋白基因, 以EcoRⅠ和KpnⅠ为双酶切位点设计引物, 构建了可口革囊星虫铁结合蛋白真核表达载体pPink-HC-fer, 经PCR 及测序检验, 序列完全正确, 然后电转化至酵母细胞中诱导表达, 经SDS-PAGE检验其融合蛋白分子量大小约为23kDa。