PaCLR介导PaLECT2激活脂多糖刺激的香鱼(Plecoglossus altivelis)单核巨噬细胞功能

香鱼(Plecoglossus altivelis)白细胞衍生趋化因子2(leukocyte cell-derived chemotaxin 2,PaLECT2)可以激活香鱼头肾来源的单核巨噬细胞(monocytes/macrophages,MO/MΦ),提高细菌感染后香鱼存活率。进一步研究显示,PaLECT2与香鱼C型凝集素受体(C-type lectin receptor,PaCLR)相互作用可激活静息状态下香鱼MO/MΦ,增强其免疫活性。在前期基础上,本研究通过抗体封闭实验检测PaCLR是否介导PaLECT2激活LPS刺激的MO/MΦ功能。结果显示,重组PaLECT2成熟肽(rPaLECT2m)显著提高了LPS刺激的香鱼MO/MΦ细胞因子的表达,并增强了其吞噬能力和杀菌活性。封闭PaCLR显著抑制了rPaLECT2m激活LPS刺激的香鱼MO/MΦ细胞因子表达、吞噬和杀菌功能。因此,PaCLR介导PaLECT2可以激活病理状态香鱼MO/MΦ。这一认识进一步揭示了LECT2在病理状态的鱼类巨噬细胞调控和炎症反应中的作用及机制。     

香鱼(Plecoglossus altivelis)铁蛋白的分子鉴定、表达及功能研究

铁蛋白(Ferritin,Fer)是一类广泛存在于生物体内、并与铁代谢密切相关的铁储存蛋白。本研究通过香鱼(Plecoglossus altivelis)单核/巨噬细胞转录组测序获得铁蛋白亚基基因(Pa Fer)c DNA全序列,结果显示,Pa Fer由943个核苷酸组成,开放阅读框为531bp,编码176个氨基酸,预测相对分子质量为20.4k Da,等电点为5.46。氨基酸序列多重比对结果显示,Pa Fer具有保守的铁蛋白样双铁结构域,与虹鳟(Oncorhynchus mykiss)和大西洋鲑(Salmo salar)Fer M亚基(Fer-M)同源性最高,均为92%;系统进化树分析表明,Pa Fer与胡瓜鱼、大西洋鲑和虹鳟的Fer-M聚为一个小簇,与虹鳟Fer-M进化相关性最高。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q PCR)结果表明,Pa Fer m RNA主要在香鱼脾脏中表达量最高,肾脏、鳃、脑和心脏中次之;鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染后,香鱼肝脏、脾脏和肾脏等组织中Pa Fer m RNA表达显著上调。原核表达了Pa Fer重组蛋白(r Pa Fer),r Pa Fer以包涵体形式表达,镍柱亲和层析纯化重组蛋白,尿素梯度透析法复性r Pa Fer。铁螯合实验结果显示,当r Pa Fer浓度为4μg/m L时,螯合铁的能力最大,为43.96%。抑菌实验结果表明,r Pa Fer对鳗弧菌、溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)和创伤弧菌(Vibrio vulnificus)的最小抑菌浓度分别为1.5625、25.0和100.0μg/m L。综上,Pa Fer与香鱼抗病原感染的免疫反应紧密相关,可能通过调控铁代谢参与鱼类抵抗微生物的宿主自身免疫过程。本研究为进一步研究鱼类Fer的功能及在病原菌感染免疫中的分子机制奠定基础。     

副溶血弧菌特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)对凡纳滨对虾幼体被动免疫和育苗成活率的影响

将抗高致病性副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)特异性卵黄抗体(AHPND-VpIgY)应用于育苗生产,通过测定氨氮、亚硝酸盐、细菌总数、弧菌总数、相对保护率和育苗成活率,评价了AHPND-VpIgY在育苗期对凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)幼体的保护效果。结果表明,0.1g/m3和0.2g/m3AHPND-VpIgY组的相对保护率为35.7%和57.2%,两者均显著高于非特异性卵黄抗体组(P0.05);两组的育苗成活率为50.8%和57.2%,比对照组分别提高19.1%和25.6%。各实验组氨氮、亚硝酸盐、细菌总数及弧菌总数与对照组无显著差异,对水质无影响。综上,特异性的AHPND-VpIgY能在不改变水质的前提下,有效提高凡纳滨对虾幼体的存活率、相对保护率和育苗成活率,从而提高凡纳滨对虾苗种产量和质量。     

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)在双壳贝类中的感染情况研究

采用国际兽医局推荐的传染性皮下及造血组织坏死病毒(infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)检测方法,首次开展IHHNV在双壳贝类(中国蛤蜊、泥蚶、花蛤、缢蛏、文蛤和白蛤)和螺类软体动物(螺蛳、中华圆田螺)中的感染情况。此外,本研究以泥蚶为研究对象,建立了IHHNV在双壳贝类中的实验室感染模型,研究了人工感染泥蚶后IHHNV在其体内的增殖和致病情况。结果显示:在采集的不同种类贝类样品中均检测到IHHNV,其中在泥蚶中的阳性率最高(50%),在文蛤中的阳性率最低(15%),表明IHHNV在双壳贝类中的分布较为广泛,是IHHNV的重要携带物种。在采集的螺类软体动物中均未检测到IHHNV。系统发育分析表明,来自不同贝类中的IHHNV构成了进化树中不同的分支,其中中国蛤蜊、花蛤、白蛤源的IHHNV属于Ⅱ型感染株,而泥蚶、缢蛏、文蛤源的IHHNV单独成簇,形成了一个全新的分支。实验室感染结果显示,IHHNV对泥蚶没有明显的致病性,但可在其体内增殖,在感染后第5天其体内的病毒载量达到最大(1.8×104copies/g),随着感染时间的增加,其体内病毒含量呈现递减趋势,但在感染后第30天体内仍可检测到病毒的存在。本研究结果对对虾养殖尤其是虾贝混养模式中预防和控制IHHNV的传播具有重要意义。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)白细胞介素10(IL-10)基因克隆及溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后表达变化分析

白细胞介素10(interleukin10,IL-10)是鱼类先天性免疫因子之一,在炎症反应和免疫调节中有着重要作用。本研究获得大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因cDNA序列,由899个核苷酸组成,含1个555bp的开放阅读框、编码184个氨基酸,预测编码蛋白分子量为21.24kDa、N端有22个氨基酸组成的信号肽序列。氨基酸序列多重比对表明大黄鱼IL-10具有IL-10家族特征性序列和构成2对二硫键的4个保守性半胱氨酸,与欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)IL-10序列相似性最高(78.5%);系统进化树分析显示大黄鱼IL-10和其他鱼类IL-10形成一个大簇,与欧洲鲈进化关系最近。荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测结果显示健康大黄鱼IL-10基因在鳃和肠中高表达,肝和头肾中低表达;溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)侵染后大黄鱼肠、脑、脾、肝和头肾中IL-10基因表达量均显著上调(P0.05),其中头肾和肝中上调幅度最大(分别为菌侵染前的10.06倍和8.79倍)。综上,大黄鱼IL-10基因表达与病原菌感染密切相关,为深入研究大黄鱼IL-10的生物学功能及免疫机制提供了基础资料。     

梅氏新贝尼登虫(Neobenedenia melleni)卵黄铁蛋白的cDNA克隆、原核表达及抗血清制备

从cDNA文库中获得了梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白(NmYF)的编码序列。序列全长739个核苷酸,3′-末端具有polyA尾,单一大开放阅读框编码一个由226个氨基酸组成的分子量为26.1kDa的蛋白。序列比较表明,NmYF与卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白最相似,氨基酸序列同源性为23.7%。系统进化树分析表明,NmYF、卫氏并殖吸虫卵黄铁蛋白和头槽绦虫卵黄铁蛋白形成了一个小的进化簇,而体铁蛋白序列形成了一个大的进化簇,揭示了卵黄铁蛋白和体铁蛋白间的差异以及进化上的相关性。这是梅氏新贝尼登虫卵黄铁蛋白基因序列的首次报道。随后,构建了插入有全长NmYF基因开放阅读框序列的原核表达质粒pET-22b-NmYF,转化大肠杆菌BL21pLysE菌株,经IPTG诱导表达后,SDS-PAGE检测表明预期大小的目的蛋白大量表达。随后制备了目的蛋白的多克隆抗血清,它能与目的蛋白起强的特异性反应,但与细菌自身蛋白不起反应,可用于后续研究。     

CMA-GFS 4DVar边界层过程线性化的改进北大核心CSCD

持续发展和优化切线性模式的线性化物理过程,保持与非线性模式一致是改善四维变分同化(4DVar)分析和预报效果的有效方法之一。目前业务系统的CMA-GFS模式采用基于Charney-Phillips(C-P)跳点的边界层参数化方案,而CMA-GFS 4DVar系统中采用基于Lorenz跳点的边界层线性化方案。为改善CMA-GFS 4DVar系统的边界层分析和预报效果,基于C-P跳点的边界层参数化方案研发了新边界层线性化方案,并通过对方案中地表热量通量和水汽通量扰动、自由大气的理查逊系数扰动、边界层的热量和动量交换系数扰动等进行更加精细地规约化约束,在确保CMA-GFS切线性和伴随模式稳定运行的情况下,减少线性化过程对切线性模式预报精度的影响。切线性近似试验检验表明:相较于原方案,新边界层线性化方案可以减少边界层位温和比湿的相对误差,最大可减少10%。批量4DVar循环同化试验表明:新边界层线性化方案可以有效改善切线性模式对低层位温、风场和比湿扰动的预报精度,减少4DVar内外循环目标泛函的相对差异,并提高700 hPa位势高度的可预报时效。     

Development and evaluation of a DNA microarray assay for the simultaneous detection of nine harmful algal species in ship ballast and seaport waters

Rapid, high-throughput and reliable methods are urgently required to accurately detect and monitor harmful algae, which are responsible for algal blooms, such as red and green tides. In this study, we successfully developed a multiplex PCR-based DNA microarray method capable of detecting nine harmful algal species simultaneously, namely Alexandrium tamarense, Gyrodinium instriatum, Heterosigma akashiwo, Karenia mikimotoi, Prorocentrum donghaiense, Prorocentrum minimum, Ulva compressa, Ulva ohnoi and Ulva prolifera. This method achieved a limit of detection (LOD) of 0.5 ng of genomic DNA (orders of magnitude of the deci-nanogram range) in the tested algae cultures. Altogether, 230 field samples from ship ballast waters and seaport waters were used to evaluate the DNA microarray. The clinical sensitivity and specificity of the DNA microarray assay in detecting field samples were 96.4% and 90.9%, respectively, relative to conventional morphological methods. This indicated that this high-throughput, automatic, and specific method is well suited for the detection of algae in water samples.     

海水养殖环境中拟除虫菊酯类农药降解菌的分离鉴定及降解特性研究

从近岸海水养殖环境中分离获得一株能高效降解氯氰菊酯(Cypermethrin,CYP)和溴氰菊酯(Deltamethrin,DEL)的菌株HS-10,经生理生化和16S rDNA分析,初步鉴定其为假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)。不同降解条件下的实验结果表明,菌株HS-10在pH 7.0、温度28°C的环境中具有较好的生长和降解效率,在该条件下,对初始浓度为100mg/L的CYP和DEL的降解效率分别为75.6%和90.9%。进一步采用发光细菌和核磁共振(NMR)方法对菌株HS-10的降解产物进行分析,结果表明,CYP和DEL主要通过微生物降解消除,其降解产物的毒性显著降低。同时,考察了菌株HS-10对氯氰菊酯、溴氰菊酯、联苯菊酯(BIF)、氟氯氰菊酯(CYF)和氰戊菊酯(FEN)5种拟除虫菊酯类农药(浓度分别为100mg/L)的降解效率,结果表明,对5种农药的降解率均达到50%以上,本研究获得的菌株HS-10可用于海水养殖环境中拟除虫菊酯类农药残留污染的生物修复。