利用实时荧光定量PCR法测算红螯螯虾实体组织的细胞数量

螯虾是重要的水产养殖动物,也是研究甲壳动物疾病与免疫的一个良好模型.在研究不同组织的功能及受病原感染的影响时,需要了解组织内的细胞数量.但是,目前常用的细胞计数方法仅适用于单细胞悬液,无法用于实体组织.本研究以红螯螯虾( Cherax quadricarinatus)为对象,建立了基于基因拷贝数定量分析的实体组织细胞数...     

红螯螯虾网格蛋白轻链的克隆及制备抗体的检测

网格蛋白为三脚蛋白复合体,其介导的内吞作用是病毒侵染细胞的常用途径之一.而对虾白斑综合症病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业的主要病原,为了研究分析WSSV的侵染机制及进入宿主细胞的途径,在本研究中,克隆得到红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)网格蛋白轻链的c DNA全长,并将其命名为Cq CLC(Genbank登录号为KR075008).进化树分析表明,其与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的网格蛋白轻链进化距离较近.此外,在其蛋白序列中选择抗原性较好的片段合成多肽,并以此制备单克隆抗体,而后经免疫荧光和western blot检测从中筛选出具有特异性的抗体,为进一步对WSSV侵染虾细胞机制及入胞途径的研究奠定了基础.     

红螯螯虾虹彩病毒在两种螃蟹内的研究

最近报道从患病的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)中分离出一种新的虹彩病毒,被暂时命名为红螯螯虾虹彩病毒.它还能感染克氏原螯虾(Procambarus clarkii)和凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei),为了探究红螯螯虾虹彩病毒是否能够感染同属于甲壳纲、十足目的螃蟹.选取中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)和粗腿厚纹蟹(Pachygrapsus crassipes)作为实验对象,应用实时荧光定量PCR技术和透射电子显微镜技术,结论证明了红螯螯虾虹彩病毒能够感染中华绒鳌蟹和粗腿厚纹蟹.推测其他蟹类也可能是其潜在的宿主,这暗示着红螯螯虾虹彩病毒对螃蟹的养殖是一种潜在的威胁.     

维生素E对红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)繁殖性能的影响

采用单因素方差分析等方法,进行不同VE含量的饲料投喂试验研究,以观察其对红螯螯虾繁殖性能的影响。结果表明,红螯螯虾雌虾增重率、性腺指数、单个虾抱卵卵重、单个虾抱卵数量、单个卵卵重及孵化率均以饲料3组最高,以上指标分别为(30.42±1.55)%、6.55±1.10、(2.86±0.11)g、(563±18)ind、(5.08±0.09)mg/ind和(45.53±3.88)%。各组受精卵中,必需氨基酸的总量、总脂的湿重和干重也以饲料3组最高,分别为(37.23±0.0207)%、(18.55±1.14)%和(31.69±1.04)%。无论中性脂还是磷脂中,各组受精卵的脂肪酸组成基本相同,均以C16∶0、C16∶1、C18∶1ω9和C18∶2ω6为主;另饲料3组中C20∶4的含量较低,而C20∶5ω3和C22∶6ω3的含量较高。说明饲料中VE含量为(0.0192±0.0023)%时可明显提高红螯螯虾的繁殖性能。VE主要是通过提高红螯螯虾受精卵的质量,而进一步提高胚胎发育的成活率和孵化率。     

日本沼虾鳃细胞的超微结构

研究了日本沼虾鳃的 3种细胞的超微结构。鳃丝角质层下的上皮细胞层比较薄 ,其近角质层侧细胞膜具有微绒毛。位于鳃丝中隔表面的上皮细胞 ,为假复层状结构 ,含有大量的糖原颗粒和线粒体。颗粒细胞内充满了丰富的高尔基体、粗面内质网及大型的球状分泌颗粒。其颗粒内含有絮状物质或斑纹状物质。肾原细胞主要分布于鳃轴内血管腔的表面 ,其细胞膜内陷形成许多足突及过滤孔 ,细胞质中充满了各种大小的泡、包被泡和管道     

白斑症病毒(WSSV)对克氏原螯虾血细胞的感染规律

用WSSV粗提液注射感染克氏原螯虾,感染后每24 h采集螯虾血细胞。血细胞经与抗WSSV单克隆抗体及FITC标记的羊抗鼠抗体结合反应后,应用流式细胞仪检测WSSV对血细胞的感染,同时记录螯虾累积死亡率及血细胞密度。结果表明,感染WSSV后螯虾1~7 d的累积死亡率分别为3.3%,13.3%,16.7%,36.7%,70.0%,90%和100%;1~5 d血细胞被感染比例分别为6.47%,6.93%,10.65%,26.08%和4.94%;1~5 d被感染细胞的平均荧光强度分别为10.7,10.89,11.71,13.77和15.47;1~6 d血细胞密度分别为(7.56±0.30),(5.60±0.24),(4.21±0.30),(1.45±0.26),(1.21±0.21)和(1.14±0.18)×106个/mL,阴性对照组螯虾血细胞密度为(5.34±0.22)×106个/mL。可见,感染WSSV后螯虾血细胞密度呈现先升后降的趋势,至感染后第6天血细胞密度仅为对照组的21.3%;被感染血细胞内的病毒量始终呈上升趋势、达到最高感染率时螯虾处于濒死状态,表明血细胞的WSSV感染与螯虾死亡密切相关。     

背景色对红螯螯虾生长、存活、体色及栖息行为的影响

本研究通过设置5种不同背景色(白色、红色、绿色、蓝色、黑色),以探究背景色差异对红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)生长、存活、体色及栖息行为的影响。结果表明养殖56d后黑色背景色组红螯螯虾体重增长量、特定生长率和成活率最高,分别为32.66 g、1.74%和76.4%,其次为绿色、蓝色和红色背景色组,白色组最差(P<0.05);黑色和红色背景色红螯螯虾饵料系数最小(3.73～3.80);黑色背景色条件下红螯螯虾体色偏蓝, ImageJ分析表明,黑色背景色组虾壳RGB值中R和G值显著低于其他各组,黑色背景色虾壳虾青素含20.23 mg/kg,亦显著低于其他各组(69.34～82.15 mg/kg)(P<0.05);黑色背景色条件下红螯螯虾分布于遮蔽物外的几率显著高于其他各组(P<0.05)。综上所述,背景色能够影响红螯螯虾生长存活、体色及行为分布,养殖中采用黑色作为背景色能够显著提高红螯螯虾生长存活,改善虾体颜色。     

南大西洋热液区盲虾虾鳃可培养附生菌多样性分析

对来自于南大西洋洋中脊(SMAR)的盲虾Rimicaris sp.虾鳃中的附生好氧菌及厌氧菌进行了富集培养,共分离得到14株低温好氧菌和2个稳定的厌氧富集菌群.通过对好氧菌的16S rDNA序列系统发育分析,发现14株低温分离菌株分别属于海源菌(Idiomarina)、海杆菌(Marinobacter)、涅斯捷连科氏菌(Nesterenkonia)、赤杆菌(Erythrobacter)、盐单胞菌(Halomonas)、交替单胞菌(Alteromonas)、嗜冷菌(Psychrobacter)、Mesonia8个属,其中9株属于变形菌门(2株属于α-变形菌纲,占总菌株数的14.3％;7株属于γ-变形菌纲,占总菌株数的50.0％).对2个厌氧富集菌群的16S rDNA文库的39个阳性克隆子进行分析,获得2种基因型,分别为γ-变形菌纲的产碱杆菌属(Alcaligenes)和β-变形菌纲的嗜麦芽寡营养单胞菌属(Stenotrophomonas).结果表明,南大西洋洋中脊盲虾虾鳃附生菌类型较为丰富,对于附生菌的研究能够更加全面的认识盲虾与附生菌之间的相互作用.     

淡水经济虾类红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)不同规格肌肉营养组成及表型性状分析

红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)又名澳洲淡水龙虾,属于名贵的淡水经济虾类,对环境条件耐受性强,出肉率明显高于其他品种。分别对4种体重规格红螯螯虾肌肉营养组成和表型性状进行系统性分析,采用国标法测定肌肉粗蛋白、粗脂肪及粗灰分含量,采用氨基酸分析仪测定肌肉氨基酸含量及组成,采用气相色谱法测定肌肉脂肪酸组成。结果表明,红螯螯虾全长和体长显著增加(20～80g组),雌虾全长和体长显著高于雄虾(60～80g组);头胸甲长和头胸甲宽以80～100g组雄虾最大,在60～80 g组中雌虾显著高于雄虾,头胸甲高在规格60 g以上不再有显著变化;腹部肌肉重以80～100 g组雄虾最大,但与60～80 g组雌虾无显著性差异,各组雌虾出肉率显著高于雄虾(P<0.05)。肌肉粗脂肪含量以80～100 g组雄虾最高,40～60 g组雄虾最低(P<0.05);肌肉灰分含量小规格20～40 g组较高,40～60 g组雌虾最低。红螯螯虾肌肉氨基酸(AA)、总氨基酸(TAA)、必需氨基酸(EAA)和呈味氨基酸(DAA)均随规格变大而逐渐降低;在氨基酸评分(AAS)模式下,各组第一限制性...     

四脊滑螯虾造血组织细胞培养条件的优化

稳定的体外细胞培养体系,可以为基因功能和宿主 病原相互作用研究提供平台。本研究通过对四脊滑螯虾(Cherax quadricarinatus)造血组织(hematopoietic tissue, HPT)细胞的体外培养条件进行优化,以期获得状态稳定、活力良好的造血组织细胞培养物。我们从四脊滑螯虾中分离提取造血组织细胞后,通过对培养基种类(L 15、Express Five、DMEM),谷氨酰胺浓度(0、1%、5%、10%),胎牛血清浓度(0、1%、5%、10%),以及体外培养温度(20、27 ℃)等培养条件进行优化。细胞形态观察和细胞活力分析结果表明,HPT细胞在添加1%青霉素 链霉素、10%L 谷氨酰胺、1%胎牛血清的L 15培养基中状态最佳,在20 ℃培养温度下能存活30 d左右。这些培养条件将有利于四脊滑螯虾造血组织细胞的体外培养。     

近江牡蛎鳃细胞的原代培养

采用改良的DMEM(HG)培养基,建立了近江牡蛎(Crassostrea hongkongensis)鳃细胞体外培养技术,包括鳃组织块培养法和胰酶消化培养法。结果表明,组织块培养法接种6 h后,细胞开始从组织块中迁出,细胞形态较小,呈圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm。培养至3 d时,细胞在组织块周围形成生长晕。培养至6 d时可进行细胞传代,本次实验细胞已传至第6代。胰酶消化法接种约2 h后,细胞逐渐贴壁,从形态上主要分为两类,一类为小型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径3～6μm,数量多,增殖速度较快;另一类为大型细胞,形态为圆形、椭圆形或多边形,直径10～20μm,部分细胞内部含有颗粒,数量较少,增殖速度较慢。培养至2 d时可进行细胞传代,传代培养物中的优势细胞皆为小型细胞。本次实验细胞已传至第6代。     

基于转录组数据的青蛤微卫星标记开发与验证

本研究利用青蛤(Cyclina sinensis)的转录组信息开发微卫星标记,共获得12418个微卫星位点。其中单核苷酸重复次数最多,共8422个,占比67.08%;其次是三核苷酸重复,共1501个,占比12.09%;双核苷酸的重复有1419个,占比11.43%。在所有重复单元类型中,A/T重复出现频率最高,占单核苷酸重复的48.75%。随机选取81对引物进行微卫星标记验证,最终获得27个具有多态性的微卫星标记。对30个青蛤进行多态性位点检测和评价,共扩增到等位基因99个,每个位点的等位基因数Na为2~6个,期望杂合度He为0.0333~0.8085,观测杂合度Ho为0.0000~0.6786,多态信息含量(PIC)为0.0323~0.7645,有19个位点显著偏离Hardy-Weinberg平衡(p<0.01)。本研究开发的微卫星标记为青蛤的分子遗传学研究、种质鉴定和自然种群资源保护等研究提供了基础数据。     

中国沿海贪食共生藻的形态、超微结构和分子特征

共生藻属( Symbiodinium)主要指一类与无脊椎动物或原生生物共生的甲藻,是热带和亚热带海洋生态系统常见物种.本研究从中国沿海和一艘停靠在厦门港的货轮压舱水中分离出了4株贪食共生藻(Symbiodinium voratum).贪食共生藻运动细胞较小(长9.7±1.3 μm,宽8.7±0.9 μm) ,能够产生不...     

海南岛附近海域肉芝软珊瑚的鉴定

肉芝软珊瑚属(Sarcophyton)是珊瑚礁生态系统中常见的软珊瑚,具有极强的药用价值.我国肉芝软珊瑚种类资源十分丰富,但目前国内对此种珊瑚的分类研究处于停滞状态,肉芝软珊瑚外部形态差异较小,难以直接进行种类鉴定.本研究采集海南省三亚市西瑁岛、万宁市甘蔗岛和大洲岛珊瑚礁区的26个肉芝软珊瑚样品,根据骨针形态学初步鉴定,并分析线粒体msh1基因和COI基因序列进行种类鉴定.结果显示:所有采集的26个样品,鉴定为5个种,分别为:Sarcophyton cherbonnieri、Sarcophyton crassum、Sarcophyton trocheliophorum、Sarcophyton glaucum和Sarcophyton ehrenbergi.其中S. cherbonnieri和S. crassum为我国新纪录种.本研究为海南岛附近海域肉芝软珊瑚的鉴定提供参考,并为我国软珊瑚种类鉴定和生物多样性的研究提供基础数据.     

文蛤鳃组织内共生菌分离鉴定和多样性分析

为探究文蛤(Meretrixpetechialis)鳃组织内共生菌群的群落组成及结构,采用纯培养方法,对文蛤鳃组织的内共生菌进行了分离、纯化和16S rRNA鉴定,共筛选到215株细菌,分属于变形菌门、厚壁菌门、拟杆菌门和放线菌门4个门级类群中,其中变形菌门是实现纯培养菌株数量最多的类群。基于16SrRNA序列信息,进一步对变形菌门的系统演化关系进行了分析,结果显示不同纲级类群的菌株分别聚集在了相应的分支内。另外,对获得的具有潜在抑菌活性或致病性的共生细菌进行了探讨,为后续对文蛤鳃内生菌的深入研究奠定了基础。     

杂色鲍血细胞分类、结构和免疫功能的流式细胞术分析

应用流式细胞术对杂色鲍(Haliotis diversicolor Reeve)血细胞的分类、结构和免疫功能进行分析。根据细胞前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)强度的不同,可将血细胞分为三个亚群:透明细胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞,组成比例分别为32.71%、58.17%和8.55%。血细胞的平均总凋亡和死亡率为3.76%。血细胞对荧光微球的总吞噬率为63.67%,其中吞噬1个、2个、3个及以上荧光微球的血细胞分别占22.31%、16.39%、24.96%。线粒体数量、溶酶体数量、非特异性酯酶活性和非诱导性活性氧(ROS)含量均在大颗粒细胞中最高,透明细胞最低。结果表明,杂色鲍三类血细胞在结构和功能上均存在差异,两类颗粒细胞可能在鲍类免疫过程中发挥着更为重要的作用。