扁浒苔PCR 快速检测方法研究

扁浒苔(Ulva compressa)能够导致绿潮灾害,对其开展快速检测技术研究是预防和控制其危害的重要技术手段。根据石莼属不同种类核糖体基因转录间隔区域(ITS)的序列设计了一对检测扁浒苔的特异性引物,并对其反应条件和体系进行了优化。PCR特异性检测结果表明,供试扁浒苔均扩增出与预期大小相一致的330 bp产物,而对缘管浒苔(Ulva linza)、浒苔(U.prolifera)、曲浒苔(U.flexuosae)、孔石莼(U.pertusa)的检测结果全为阴性。PCR灵敏度试验表明,该PCR体系最低可以检测到10 pg的扁浒苔DNA模板。本快速检测方法为扁浒苔的早期识别与有效治理提供了科学依据,对相关扁浒苔产业和生态学等研究也具有一定参考意义。     

不同温度与营养盐条件对浒苔（Ulva prolifera） 和肠浒苔（Ulva intestinalis） 的生长影响

2010 年4 月采集了江苏省南通市如东县紫菜养殖筏架上的浒苔（Ulva prolifera） 和肠浒苔（Ulva intestinalis） 样品, 对两种浒苔在不同温度和营养盐环境下的生长情况进行了研究,分析了其不同生长特点及对环境变化的响应。结果表明,浒 苔（U. prolifera）在15 益~25 益范围内,在浓度相对较高的营养盐组相对生长率较高。肠浒苔（U. intestinalis）在温度为10 益~ 20 益范围内,在浓度较低的营养盐组相对生长率较高。在两种浒苔相对生长率达到最大的同时,其对于营养盐的消耗量也达 到最大。据此,推测两种浒苔自身的生理生态特征及其对环境变化的响应是影响其生物量的重要因素。     

苏北浅滩沉积物中的大型绿藻微观繁殖体的垂直分布和物种多样性

本研究通过在2017年秋冬季组织实施的2个绿潮种源调查航次,研究苏北浅滩紫菜养殖区沉积物中的大型绿藻微观繁殖体的垂直分布和物种多样性。对沉积物中的微观繁殖体的定量实验结果表明:表层泥样中绿藻微观繁殖体的丰度最高,随着深度的增加迅速降低。在9月份表层沉积物中丰度为9±2ind./g,而在11月份表层丰度达到98±25ind./g;与9月份相比, 11月份浅滩沉积物中绿藻繁殖体数量呈现出显著升高的趋势。通过对51个绿藻样品的分子鉴定发现:沉积物中存在石莼属(Ulva)、尾孢藻属(Urospora)、盘苔属(Blidingia)等大型绿藻的微观繁殖体;数量占优是石莼属繁殖体,主要包括曲浒苔(Ulva flexuosa)、浒苔(Ulva prolifera)、扁浒苔(Ulva compressa)、缘管浒苔(Ulva linza);其中曲浒苔占据的比例最高,在9和11月份分别达到80.94%和73.33%。在2个调查航次中,都从沉积物中发现了绿潮浒苔的微观繁殖体,这些微观繁殖体是绿潮浒苔在苏北浅滩种源维持的重要方式和关键阶段,也构成了黄海浒苔绿潮连年暴发的"种子库"。     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条快速检测扁浒苔(Ulva compressa)的研究

本研究将环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)与横向流动试纸条(lateral flow dipstick,LFD)的可视化检测方法结合,建立了扁浒苔(Ulva compressa)的LAMPLFD快速检测技术。该方法以扁浒苔的内转录间隔区(ITS1-5.8S-ITS2)序列为检测靶标,设计了3对特异性引物(其中,上游内引物由生物素标记)和1条异硫氰酸荧光素标记的探针。结果表明,LAMP最适反应温度为63°C,扩增时间为60 min,从核酸扩增到LFD结果判读需70 min。利用LAMP-LFD可特异性检出扁浒苔,对浒苔、曲浒苔、缘管浒苔和孔石莼等石莼属绿藻以及塔玛亚历山大藻、无纹环沟藻、东海原甲藻、锥状斯克里普藻和赤潮异弯藻等常见微藻的检测结果为阴性。该方法最低可检测到0.1 pg的扁浒苔基因组DNA,是以Uco ITS-F3和Uco ITS-B3为特异性引物的PCR方法的100倍。对实际样品的检测结果表明,LAMP-LFD方法检测扁浒苔与传统的形态学观察的结果一致。因此,该方法可快速、特异地检测出扁浒苔,而且操作简单,仪器设备依赖性低,有潜力成为扁浒苔现场检测的常规技术手段。     

大型海洋绿藻5.8S rRNA基因序列及系统发育分析

采用PCR方法,将扩增的产物直接测序,测定了孔石莼Ulva pertusa和浒苔Enteromorpha prolifeFa的5．8S rRNA基因序列,与肠浒苔、扁浒苔、缘管浒苔、礁膜、北极礁膜、袋礁膜和格氏礁膜等7种已知的大型海洋绿藻的同一基因序列合并进行比较,分析了核苷酸序列差异和碱基替换特点,并构建系统发生树。结果表明,浒苔和孔石莼的颠换率为0．690％,小于浒苔与肠浒苔、扁浒苔、缘管浒苔的颠换率;且浒苔与孔石莼之间的Kimura双参数距离也小于浒苔与肠浒苔、扁浒苔以及缘管浒苔之间的平均Kimura双参数距离。相对于浒苔属的其他物种,浒苔与孔石莼的亲缘关系更近。在构建的系统发生树中,缘管浒苔与孔石莼聚为一类,表现出与石莼属物种更近的亲缘关系。     

海洋弧菌对青岛近岸浒苔暴发的响应研究

本研究拟针对浒苔(Ulva prolifera)暴发过程中微生物群落结构的变化规律进行探索,研究结果将对了解浒苔暴发期间的生物地球化学循环具有重要意义。本研究以海洋弧菌为研究对象,通过原位取样、传统培养以及高通量测序等分子生物学手段,探究青岛近岸浒苔暴发过程中弧菌丰度和群落组成的演替规律。研究结果表明,弧菌丰度随着浒苔暴发出现显著性增加,且主要发生在浒苔暴发末期。浒苔暴发过程中营养物质吸收与释放,特别是浒苔释放的溶解有机物(DOM),使弧菌群落结构出现明显演替,优势类群由浒苔暴发前的灿烂弧菌(Vibrio splendidus)转变为消退后的坎贝氏弧菌(Vibrio campbellii)。另外,温度和SiO₃^2-是影响弧菌丰度和群落组成的重要环境因子。     

不同状态浒苔对东海原甲藻生长的影响

近年来富营养化等海洋污染现象日益加重,我国近海每年都会暴发浒苔绿潮和微藻赤潮现象。本文在实验室模拟条件下,研究了不同状态不同含量的浒苔（Ulva prolifera）,即浒苔新鲜藻体、浒苔培养液和浒苔干粉末与东海原甲藻（Prorocentrum donghaiense）共培养时产生的竞争抑制作用。结果表明,浒苔新鲜藻体、浒苔培养液和浒苔干粉末在初始质量含量大于1 g/L的条件下都会对东海原甲藻产生抑制作用,浒苔干粉末的抑制强度远远超过浒苔培养滤液和浒苔新鲜藻体。在二者共培养时,出现了“低促高抑”的现象,即浒苔含量较低时会促进东海原甲藻的生长,而高含量的浒苔则抑制东海原甲藻的生长,且抑制作用随浒苔含量的升高而增大。浒苔对东海原甲藻的这种抑制作用,一方面可能来自于营养物质的竞争和消耗,另一方面可能来自于浒苔释放的化感物质对东海原甲藻产生的影响。利用浒苔对东海原甲藻的抑制作用,可为东海原甲藻赤潮的生物防治提供一种思路与方法。     

江苏－山东沿岸大型绿藻微观繁殖体时空分布特征研究

为研究暴发浒苔绿潮的黄海近岸水体中大型绿藻微观繁殖体时空分布和种群演替,以及绿潮对海域繁殖体群落结构的影响,本研究在江苏－山东沿岸设置4个站位,开展周年取样调查研究。通过室内培养和分子检测结合的方法,共鉴定出6种大型绿藻:缘管浒苔(Ulva linza)、浒苔(U. prolifera)、扁浒苔(U. compressa)、孔石莼(U. pertusa)、未命名种(Ulva sp.) 和盘苔(Blidingia sp.)。定量研究结果表明,各站位微观繁殖体丰度和种类组成具有明显时空变化特征,苏北浅滩与青岛近岸周年绿藻微观繁殖体丰度明显高于连云港燕尾港和日照岚山港站位;各站位丰度呈双峰型波动,春季到初夏达最高,秋季为次高峰,其他季节丰度较低。群落结构组成研究表明,苏北浅滩周年存在较高丰度的浒苔微观繁殖体(平均为77株/L),其中造成黄海大规模绿潮的“漂浮生态型”浒苔占绝对优势,年均占浒苔微观繁殖体总数的75.7%;青岛近岸微观繁殖体种类组成波动显著,在夏季大规模浒苔绿潮到达时,优势种从缘管浒苔转变成浒苔,其中,“漂浮生态型”浒苔微观繁殖体数量急剧上升,并在绿潮消退时快速消失。对比研究显示,苏北浅滩海域是浒苔微观繁殖体“栖息地”,对维持浒苔种群、造成绿潮连年暴发具有重要作用;青岛近岸微观繁殖体群落受到大规模漂浮浒苔的季节性扰动,其组成结构在绿潮暴发期发生显著变化。     

“微观繁殖体”溯源

通过查阅"微观繁殖体"相关文献,对其概念进行溯源追踪并据以总结归纳。笔者认为"微观繁殖体"这个概念不应该作为放散的孢子、配子、合子、不同生长阶段的显微个体及有生长能力的大型海藻碎片的统称,而应只是泛指那些肉眼不可见的只进行营养繁殖的二倍体细胞团、脱落下来的组织块和"色素体"(有色藻段)等碎片,即是一个或者多个二倍体的藻类细胞。并以石莼属绿藻浒苔(Ulva prolifera)为例,简述浒苔微观繁殖体在其生活史中的主要作用,为浒苔"微观繁殖体"的理论研究和实际利用奠定基础。     

防城港核电站周边海域绿潮藻类的组成及时空分布

绿潮通常由石莼属（Ulva）藻类形成,可对沿岸工业、旅游等产生不利影响,甚至影响核电站冷却水取水安全。河口和富营养化的沿海地区是易发生绿潮的区域,钦州湾呈富营养化态势。为了解钦州湾大型海藻对防城港核电站冷却水取水安全的影响,文章调查评估2020年12月至2022年2月退潮期间钦州湾西侧潮间带的大型绿藻生长情况。结果表明：钦州湾冬、春季有绿潮发生,时间为12月至翌年2月,持续时间约3个月,其中1月生物量最高,3月逐渐消失;绿潮持续时间的决定性因素是海水温度,绿潮发生月份与低纬度的厦门等地相近,而与中高纬度地区差异较大;钦州湾绿潮由3种石莼属藻类组成,按出现时间先后分别为条浒苔（Ulva clathrate）、肠浒苔（Ulva intestinalis）和长石莼（缘管浒苔）（Ulva linza）;钦州湾绿潮为石莼属藻类本土生长类型,目前未发现外地漂移来的藻类;钦州湾海水营养盐浓度较高,利于石莼属藻类生长;人类活动抑制石莼属藻类生长,滩涂养殖区未发现石莼属藻类;钦州湾绿潮对核电站冷却水安全取水具有潜在危害。