用于单一藻细胞PCR扩增反应的样品保存方法比较

用室内培养的塔玛亚历山大藻(Alexandrium tamarense ATHK藻株)作为实验对象,分别选择了5%福尔马林固定后常温保存、95%乙醇固定后常温保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液(Lugols solution)固定后常温保存等方法,在5,15,30,60 d后对保存的样品进行单细胞PCR反应,并与新鲜样品进行比较。实验结果表明,用95%乙醇保存、-20℃冷冻保存、鲁哥氏液保存的样品在60 d后仍可扩增出目标条带,与新鲜样品没有差别,但是样品中的藻细胞形态有一些改变;而以5%福尔马林固定保存的样品只能在5 d后扩增出目标条带,但藻细胞形态比较完好。因此,对用于单细胞PCR实验的微藻样品,短期内(不多于5 d)可以采用福尔马林保存,而需要长期保存的样品,应当采用乙醇或鲁哥氏液固定,或者采用-20℃冷冻保存的方法。     

海湾扇贝样品不同保存条件下DNA的提取及RAPD扩增比较

以海湾扇贝为材料，研究了鲜活样品以及采用冷冻保存、70％乙醇固定和10％福尔马林固定等方法保存的闭壳肌样品用于DNA提取的不同效果，并分析了不同保存条件下所提得DNA用于RAPD扩增的结果，研究表明，鲜活样品以及采肜冷冻保存和70％乙醇固定的样品可以得到很好的DNA，其质量和得率没有显著差异，利用上述DNA模板进行RAPD分析，可以获得一致性很好的扩增结果。10％福尔马林休固定样品则没有得到可用的DNA模板。采用70％乙醇固定保存海洋生物组织，是用于DNA提取及相关的分子生物学研究的快速、简易和有效的方法。     

不同保存方法的大黄鱼肌肉样品基因组DNA提取及RAPD分析

以－20℃冷藏、70％（V／V）乙醇、含50mmol/dm^3 EDTA的70％（V／V）乙醇和10％（V／V）福尔马林保存等方法处理大黄鱼肌肉样品，进行了DNA的提取及RAPD分析，并与新鲜样品作了对照。实验结果表明，鲜活样品以及冷冻保存、70％（V／V）乙醇以及含50mmol/dm^3EDTA的70％（V／V）乙醇保存的样品均可得到高质量的DNA，大小在21kbp左右，含量为100μm/cm^3左右。而从10％（V／V）福尔马林保存样品也能提到DNA，但其DNA得率低，约10μg/cm^3。分别以上述提取的DNA为模板进行RAPD扩增，未见有明显的差异。     

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RM基因PCB扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇 0．05mol／L FDTA(pH8．0)和5％海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备RR模板DNA,而5％海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。     

海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响

为了研究海萝的非繁殖季节孢子育苗方法,进行了2个实验来研究海萝种藻冷冻保存对其释放孢子量及孢子附着的影响。1)6组不同风干程度海萝种藻在18℃冷冻保存6个月后取出在16℃水中进行孢子的释放,种藻风干到干重为原鲜重约25%的组,孢子的保存效果最好,该组种藻释放孢子量约为对照组(未经风干和保存的种藻)的77.6%,且孢子的附着率与对照组的差异性不显著;2)风干到重量为原鲜重约1/4的种藻分别保存于18℃、36℃、80℃,在保存8个月后,每一保存温度下的种藻分别在8℃、12℃、16℃、20℃水中释放孢子,种藻在水温12℃下释放的孢子量最多;保存于36℃、80℃的种藻较保存于18℃的释放孢子量多。本实验结果为海萝的非繁殖季节孢子育苗找到一种简便的方法,也为该属藻类的种质保存提供了参考。     

两种海洋单胞藻浓缩与保存效果的研究

研究了小球藻和球等鞭金藻分别用明矾和石灰水浓缩以及两种藻的浓缩液在常温(20 ±1℃)、低温(0—4℃)﹑冷冻(-30±1℃)三种温度条件下保存的结果,并对浓缩保存前后藻液的饵料效果进行了对比试验。 结果表明:(1)小球藻的浓缩以80±5ppm的明矾液及4%的石灰水效果最好;(2)球等鞭金藻的浓缩以100±10ppm的明矾液及6%的石灰水效果最好; (3)保存方法以加入保护剂甘油并置于-30℃ 冰箱中效果最好,小球藻和球等鞭金藻的存活率分别为95%和93%;(4)低温保存前后藻的脂肪酸分析结果表明高度不饱和脂肪酸(HUFA)的含量变化不明显;(5)用浓缩保存藻投喂中国对虾和轮虫的效果与普通藻无显著差异。     

纤毛虫单细胞基因组DNA微量提取方法的比较及优化

在纤毛虫的分子生物学研究中,单细胞基因组DNA的微量提取是后续基因分析的关键。本研究以海洋纤毛虫红色伪角毛虫为材料,采用直接取完整虫体、裂解法以及3种改良后的试剂盒微量提取DNA方法,分别提取了新鲜样品与4种不同方法保存样品的基因组DNA,比较了9种组合在PCR产物质量、提取所需时间、成本及便捷性方面的优劣,并进一步比较、讨论和探索了4种样品保存方法和5种DNA微量提取方法在纤毛虫单细胞基因组PCR扩增中的可行性。本工作旨在为后续的纤毛虫分子生物学研究提供可资借鉴的技术路线和方法。     

不同保存方法对厚壳贻贝样品蛋白提取效果的比较

为了解厚壳贻贝(Mytilus coruscus)稚贝样品在冷冻保存过程中的蛋白变化情况,作者采用直接冷冻法、添加海水冷冻法、蛋白裂解液冷冻法等分别对保存1周至6个月的厚壳贻贝样品蛋白提取的不同效果进行了比较。SDS-PAGE胶结果显示,3种冷冻保存方法均出现4个有规律条带(a、b、c、d),其相对分子量依次约为55、46、38和26kDa。SDS-PAGE蛋白条带灰度值的检测结果表明,1个月内蛋白裂解液法保存的样品最佳;直接冷冻法和添加海水冷冻法的研究发现保存过程中的蛋白均出现不同程度的降解现象,因而可能不适宜用于该种稚贝样品的保存。     

舟山近海环境DNA保存方法的建立及优化

近年来,环境DNA(environmentalDNA,eDNA)技术开始被广泛应用于水生生物多样性研究。本文通过绝对定量和高通量测序技术对舟山近海高浊度水样eDNA的保存方法进行了建立和优化。研究结果如下:(1)"酒精+低温"保存法的eDNA获得量是"酒精+常温"保存法的0.78—1.06 (7d)、0.89—1.80 (15d)、1.05—2.75 (30d)和2.69 (60d)倍;(2)酒精保存法(低温、常温)存在eDNA富集物渗漏及滤膜黏附现象;(3)短期内冷冻保存样品的eDNA获得量是酒精保存样品获得量的1.25—1.59倍(7d)和1.07—1.20倍(15d);(4)酒精保存法的eDNA降解速率慢于冷冻保存法,长期内酒精保存样品的eDNA获得量是冷冻保存样品获得量的1.99—2.10倍(30d)和2.84—7.64倍(60d);(5)二次富集(过滤)能显著提高eDNA获得量,富集组eDNA浓度是未富集组浓度的1.60—4.95倍("酒精+低温")和1.21—2.04倍("酒精+常温");(6)"酒精+低温"保存的样品在高通量测序总丰度、各鱼种分丰度、物种多样性指数等多个方面优于冷冻保存样品;(7)微生物(micro-organism)的eDNA降解速率慢于大生物(macro-organism),不同界(Kingdom)的eDNA最优保存方法可能并不相同。本研究首次建立了舟山近海高浊度水样eDNA最适保存方法,为相似水域的eDNA保存提供了借鉴参考。     

恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响

为有效抑制萱藻种质保存和丝状体扩增时膨胀色球藻的污染,本实验应用实验生态学法,研究了恩诺沙星、磺胺嘧啶和呋喃西林3种抗菌药对共培养的萱藻丝状体和膨胀色球藻生长的影响.结果显示:在5～100 mg/L范围内,50 mg/L恩诺沙星适于除去萱藻种质保存或丝状体扩增过程中出现的膨胀色球藻,实验第18 d膨胀色球藻的日均增长率...     

海绵动物保存及DNA提取方法的研究

海绵标本长期、完整的保存是开展海绵分类学及分子进化研究的重要前提, 本研究以建立通用的海绵动物标本的保存方法及快速、完整的基因组DNA 提取方法为主要目的, 通过对硅质的山海绵(Mycale sp.)和钙质的白枝海绵(Leucosoleniidae sp.)为材料进行–20℃冰冻、乙醇固定、冰冻后风干和乙醇固定后风干等4 种保存方法进行研究, 同时采用酚-氯仿法、高盐法、CTAB 法等3 种基因组DNA提取方法, 测试了4 种保存方法的DNA 提取效率。实验结果显示, 海绵样品的4 种保存方法以及3 种DNA 提取方法对于硅质海绵以及钙质海绵虽然在提取的DNA 得率上有差异, 但都能获得较高纯度基因组DNA。从经济成本、方便性、潜在的污染等因素考虑, 高盐法是首选的提取海绵基因组DNA 的方法; 乙醇固定保存的海绵样品DNA 得率最高, 冰冻的海绵样品得率最低, 推荐采用乙醇固定保存海绵样品的方法。     

固定标本的DNA提取及PCR扩增

报道福尔马林、酒精固定的日本绒螯蟹标本的 DNA提取及 PCR扩增 ,并与冷冻、煮沸标本进行了比较。结果表明 ,福尔马林固定标本与酒精固定标本一样可以提取 DNA,加入的蛋白酶 K量越多 ,DNA的回收率越高。以提取的 DNA为模板 ,进行了线粒体 DNA12 S r RNA和 D- loop基因片段的 PCR扩增 ,经琼脂糖凝胶电泳 PCR扩增产物后均得到了与期待的碱基长度相一致的清晰谱带。     

单细胞凝胶电泳用于检测低温保存的真鲷(Pagrosomus major)精子DNA损伤

应用单细胞凝胶电泳(SCGE)方法,对超低温冷冻保存的真鲷精子DNA的损伤状况进行了检测研究。针对研究对象,在实验过程中对传统的碱性单细胞凝胶电泳在铺胶方法、电泳条件等进行了改进。对精子细胞进行预处理,在碱性电泳液中使核DNA双链解链变性后电泳,EB染色10min后,在荧光显微镜下观察,每次随机观察50个左右的核DNA。结果表明,对荧光显微镜下观察到的精子核按彗尾长度及荧光强度划分等级,出现损伤的精子核DNA的损伤程度主要为轻度损伤和中度损伤,很少见有完全损伤的真鲷精子核。对比真鲷冷冻精液与新鲜精液的精子DNA的损伤状况,表明仅用30%DMSO冷冻精子DNA损伤状况与鲜精差异显著(P>95%),其他冷冻方法保存的精子与鲜精差异不显著(P>95%)。     

用于倍性检测的对虾样品的保存方法

采用9种保存方法分2个温度梯度，对待测倍性的日本对虾幼体样品进行处理，通过对利用流式细胞仪检测的不同样品直方图进行比较，筛选出一种较为理想的用于倍性检测的对虾样品的保存方法。结果表明：新鲜样品在分散液中捣碎，加入一定量的二甲基亚砜(DMSD)后可在-20℃下保存较长时间。     

漂浮铜藻室内保存及海上越冬试验

在我国南北海区经常能观察到聚集的漂浮铜藻,为有效利用铜藻资源,设计了铜藻室内保存及海上越冬试验。结果显示,铜藻在室温3℃～15℃下藻的鲜重均有不同程度下降,80μmol·m^-2·s^-2强光比20μmol·m^-2·s^-2弱光保存铜藻效果好,低温比高温保存效果好,但低于5℃后的铜藻保存效果变差。在温度5℃～17℃左右时,海上筏养铜藻特定生长率随温度升高而升高,而且藻体健壮,在冬季海水温度降到℃以下时,铜藻基本停止生长,但是藻体仍保持较好的活力,因此漂浮铜藻可在黄海南部海上顺利越冬。     

锥状斯氏藻休眠孢囊萌发调控因子的实验室研究

锥状斯氏藻Scrippsiella trochoidea是一种常见赤潮种类, 为了了解影响锥状斯氏藻孢囊萌发的内外在调控因子, 在实验室条件下研究了不同温度(15、20和25℃)、储存温度(4、15、20和25℃)、储存时间(30和60d)、营养盐含量(N: 500μg·L-1, P: 74―1.5μg·L-1;P: 74μg·L-1, N: 100―10μg·L-1)以及缺氧对锥状斯氏藻休眠孢囊萌发的影响.锥状斯氏藻孢囊的强制性休眠期在15-25d, 不同温度下孢囊最终萌发率差别不大, 为75%―82%, 但低温可减缓孢囊的萌发速度.高温(25℃)和长时间保存(30d以上), 可导致萌发率明显降低.N、P营养盐对孢囊萌发影响不明显, 缺氧和黑暗能完全抑制锥状斯氏藻的孢囊萌发.结果表明: 锥状斯氏藻孢囊较短的强制性休眠期和高萌发率, 使其孢囊在广东沿海全年各季节均具有一定的萌发能力, 并造成该藻赤潮的循环发生;同时, 当孢囊悬浮至溶氧丰富、光线合适的上层水体, 才能促进孢囊大量萌发, 从而引发赤潮.     

温度对2种饵料金藻保存效果的影响

研究了在室温25℃±2℃,4,-5,-22℃下绿色巴夫藻(Pavlova viridis)和球等鞭金藻(Isochrysis galbana)的保存效果,通过测定其存活率以及主要脂肪酸的变化情况筛选出了2种金藻的适宜保存温度。结果表明,绿色巴夫藻短期内(30~45 d)在-5℃下保存效果最好,较长期(45 d以上)保存则应在-22℃,而球等鞭金藻则在-22℃下保存效果最好。     

一种提取眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)DNA的简便方法

用氯化锂法从眼点拟微球藻(Nannochloropisis oculata)中提取DNA并对其提取条件进行了优化。新鲜藻细胞在提取液(0．6mol／L LiCl，0．8％Sakosyl，20mmol／L EDTA(pH8．0)，0．4％PVP，10mmol／L Tris-HCl(pH8．0)，5％β—巯基乙醇)中经过55℃温育30min，每mg鲜藻可提取20—40mg DNA，提取的DNA分子量在23kb左右，可用于PCR、限制性酶切等。     

球等鞭金藻3011浓缩细胞低温保存技术的研究

为了探讨球等鞭金藻3011（Isochrysis galbana Parke）浓缩细胞的保存条件,通过研究其在不同温度条件下的长期保存效果来确定最佳的保存温度范围。实验结果表明,在0～10℃的低温下长期（2个月以上）保存后,球等鞭金藻3011获得较高的存活率（70％以上）,并且在恢复生长时保持较高的比生长率,因此0～10℃是球等鞭金藻3011浓缩细胞长期保存的最佳温度范围。     

日本蟳精子获取和超低温冷冻保存技术研究

本文比较了胰酶消化法、网搓法和机械研磨法3种方法对获得游离日本蟳精子的效果。对获得的精子进行超低温冷冻保存,用曙红Y进行染色,检测精子的存活率。使用7种不同稀释液、不同浓度的二甲基亚砜(DMSO)、甘油(GLY)、1,2-丙二醇(PG)为抗冻保护剂,在6种不同的降温程序下,对日本蟳精子进行超低温冷冻保存,后在不同的温度下解冻复苏精子。实验结果表明:3种精子获取方法中以搓洗法的实验效果最好,胰酶消化法的效果次之,最差的是机械研磨法。其中搓洗法中以500目的筛绢效果最好,精子密度达2.56×10~(13)个/mL。日本蟳精子冷冻保存实验结果表明,稀释液以去钙人工海水、抗冻保护剂以5%DMSO、平衡时间20 min、降温程序P-1(0℃平衡20 min;-5℃/min降至-80℃;-80℃平衡5 min;-20℃/min降至-180℃;然后置于液氮中保存),水浴解冻37.5℃的效果最好,精子存活率最高。