酵母双杂交系统的应用及发展前景

酵母双杂交系统有利于检测蛋白质与蛋白质、蛋白质与DNA 、蛋白质与RNA和蛋白质与小分子之间的相互作用,因而对分子调控体系的研究起巨大的反 作用。文中系叙述了基于Ga14系统的双杂交技术的应用及其局限性,还介绍了单杂交系统、 双杂交系统、三杂交系统以及Sos恢复系统(SRS)。与其它领域一样,酵母双杂交系统将会在 海洋分子生物学研究中取得成功。     

鉴定病毒受体的研究方法

研究病毒受体对了解病毒感染机制、病毒病的预防与治疗、病毒分类等都有重要意义。本文重点就酵母双杂交系统以及病毒蛋白铺覆技术、噬菌体展示、生物芯片、荧光共振能量转移等可用来进行病毒受体鉴定研究的几种方法做了介绍。     

对虾白斑综合症病毒VP37基因诱饵重组载体的构建、转化与自激活作用检测

把对虾白斑综合症病毒(White syndrome spot virus,WSSV)黏附蛋白VP37的基因C末端截去102个碱基后设计了一对引物,通过PCR扩增出目的片段。用其构建酵母双杂交诱饵载体,并检测其表达产物对酵母细胞有无毒性作用和自激活活性。结果获得截短的VP37基因片段,并成功克隆入酵母双杂交系统PGBKT7 DNA-BD载体中,测序结果表明序列完全正确。把重组载体转化酵母菌AH109并检测自激活作用。结果显示表达的融合蛋白没有激活ADE2,HIS3这2个报告基因,但激活了MEL1,该融合蛋白对酵母菌AH109无毒性。可利用其它2种报告基因将其应用于酵母双杂交系统,筛选cDNA文库中与之相互作用的基因。     

酵母双杂交系统用于WSSV结构蛋白VP39相互作用的宿主蛋白基因的初步研究

为研究WSSV的结构蛋白VP39相关蛋白的基因,应用酵母双杂交系统筛选中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)鳃细胞全长cDNA文库。将构建好的VP39基因的重组载体pGBKT7-VP39转化酵母Y187后,与含文库质粒的酵母株AH109融合,在营养缺陷培养基上进行反复筛选,得到1个阳性克隆,测序并进行生物信息学分析。结果显示,此cDNA片段在数据库中是新序列,该蛋白在WSSV识别并结合宿主的过程中所起的作用还有待于进一步研究。本实验成功筛选了VP39相关蛋白的cDNA片段,为进一步研究WSSV的致病机理奠定了基础。     

条斑紫菜酵母双杂交文库的构建及PyMAPK5互作蛋白的筛选

为进一步研究条斑紫菜促分裂原活化激酶家族PyMAPK5的下游互作蛋白,理解其生物学功能,本研究通过酵母双杂交的方法进行其相互作用蛋白的筛选。提取不同温度和失水逆境胁迫下的RNA,利用Invitrogen体系构建条斑紫菜酵母双杂交cDNA文库,其库容为1.44×107CFU,重组率为91.8%。以pGBKT7-PyMAPK5为诱饵蛋白载体,利用共转化方法,从文库中筛选得到26个与PyMAPK5互作的候选蛋白。候选蛋白集中在光系统II相关蛋白、捕光蛋白、微管蛋白、ATP酶、GTP结合蛋白及假设蛋白等。微管蛋白、捕光蛋白、光系统II蛋白一对一验证结果为阳性,表明在酵母体内存在互作。本研究为阐明条斑紫菜PyMAPK5与其互作蛋白的关系及解析PyMAPK5下游作用机制奠定了基础。     

锯缘青蟹(Scylla serrata)呼肠孤病毒5个结构蛋白互作分析

采用酵母双杂交系统,对青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus)5个结构蛋白(VP3,VP6,VP9,VP11,VP12)间的双向互作进行了分析。将5个结构蛋白对应的ORF分别亚克隆至诱饵载体p GBKT7和猎物载体p GADT7,成功构建了10个酵母双杂交重组载体。将重组诱饵载体或重组捕获载体转化至酵母菌Y2H Gold中进行自激活检测,结果显示5个结构蛋白均不能激活酵母菌报告基因HIS3的表达,表明5个病毒蛋白均不具有自激活活性。通过酵母双杂交实验,从5个结构蛋白25个可能性互作对中,共筛选出2个双向互作对(VP11VP6,VP11VP12)和3个自身互作对(VP3VP3,VP11VP11,VP12VP12)。本研究是有关Ss RV结构蛋白互作的首次报道。     

利用酵母双杂交研究铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB的自身相互作用

从铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)PCC7820中克隆了生物钟基因kaiB,并将其克隆入酵母双杂交系统的两个质粒pGADT7和pGBKT7中。经测序验证后,将重组质粒pGADT7-kaiB和pGBKT7-kaiB转化酵母菌AH109进行自激活性和自身相互作用的检测和验证。结果表明,铜绿微囊藻生物钟蛋白KaiB无自激活性,KaiB蛋白自身能发生相互作用。因此,可用KaiB蛋白为诱饵利用酵母双杂交系统筛选文库钓取与KaiB发生相互作用的蛋白。     

应用酵母双杂交系统筛选虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白

FOXL2是脊椎动物的雌性决定基因,在多种无脊椎动物中也被认为是雌性决定与分化的关键基因,但其在无脊椎动物中的作用机制目前尚不清晰。本文利用Clontech酵母双杂交系统筛查虾夷扇贝FOXL2的相互作用蛋白。研究首先构建诱饵质粒pGBKT7-FOXL2,并检测诱饵蛋白的毒性及自激活活性,结果显示诱饵蛋白对酵母菌株无毒,也无自激活活性。利用该诱饵质粒,本研究从虾夷扇贝酵母双杂交cDNA文库筛选得到17个阳性克隆,测序验证得到12个读码框正确的阳性克隆,它们来自4种蛋白:COP9信号复合体亚基5、钠/钾ATP酶β3、哺乳动物室管膜相关蛋白1和胰脂肪酶相关蛋白2。研究进一步将诱饵质粒与4种蛋白的猎物质粒进行共转化验证,结果均为阳性,表明这4种蛋白与虾夷扇贝FOXL2都可能存在相互作用。本文为研究FOXL2在无脊椎动物性别决定与分化中的作用提供了参考。     

石鲽与牙鲆人工杂交的研究

研究了石鲽（♂）与牙Ping(♀）的人工杂交,杂交后代经7个多月的养殖,许多生物学特征较牙Ping、石鲽发生了较大变异。在全长相同的情况下,杂交鱼的体高比牙Ping体高增加了6％、比石鲽体高增加了4．2％,其体质量以及成活率也都分别比牙Ping、石鲽的高。其杂种优势明显。     

小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代遗传特征分析

通过对小黄鱼(♀)×大黄鱼(♂)杂交子代及其双亲染色体核型和线粒体COI基因序列的比较分析,旨在对其杂交遗传特性进行研究。其中染色体核型分析表明:小黄鱼的核型为2n=6sm+42t,NF=54;大黄鱼的核型为2n=2sm+22st+24t,NF=72;杂交子代为2n=8sm+12st+28t,NF=68。杂交子代和亲本在染色体数目上一致,但在组型上存在差异,可能是由于杂交过程中双亲染色体组发生了融合和重配。同时,对杂交子代及其亲本672bp的COI基因同源序列进行分析,表明杂交子代与其母本小黄鱼的序列几乎一致,利用Kitumra-2-Parameter-Distance双参数模型分析显示杂交子代与小黄鱼的遗传距离为0.011,该数值接近其种内平均遗传距离。基于COI基因片段序列构建的系统树显示,杂交子代与小黄鱼聚成一支。杂交子代在线粒体COI基因上表现出严格的母系遗传特征。     

利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白

采用酵母双杂交技术,对草鱼呼肠孤病毒096(GCRV096)非结构蛋白NS38相互作用的蛋白进行了筛选,并对阳性克隆中的插入序列进行测序与生物信息学分析。结果表明,含有重组质粒pGBKT7-NS38的酵母菌Y2HGold与含有草鱼肾脏细胞(CIK)cDNA文库质粒的酵母菌Y187融合成功,并筛选得到3株阳性克隆;发现两条不同的插入序列,其中一条序列编码的蛋白与40S核糖体蛋白S16亚基的同源性高达99%,而另一序列相应的蛋白不存在匹配的蛋白。该结果为进一步深入研究NS38蛋白在GCRV096复制过程中的生物学功能奠定了基础。     

藻类基因转录调控研究进展

转录调控是基因表达调控的重要方式。转录调控的研究主要集中在启动子的克隆与分析、反式作用因子(即DNA结合蛋白)的检测及转录量的检测三方面。介绍了基因组步移、凝胶阻滞、酵母双杂交系统、cDNA微阵列等基因转录调控的常用研究方法,并对藻类基因转录调控的最新研究进展进行了评述。     

酵母菌支序分类研究

本文应用支序分类法(Cladistics)对16个属的酵母进行了系统演化研究,酵母菌的分类已有多年历史,但由于形态差异很大,所以在分类上一直存在着不同的看法,亦即存在着不同的分类体系。本文研究的隐球酵母等七个属在分类地位上也有争议,有的学者认为应属于子囊菌纲,有的学者认为应属于半知菌类。本文应用支序分类方法,通过诸多遗传性状的综合系统分析,认为上述7个属的酵母从系统进化和亲缘关系上,应该与子囊菌酵母同属一个发育系统,是与子囊菌酵母平行发展的一类酵母。     

海洋动物中褪黑素信号系统的研究进展

褪黑素是神经内分泌调控的关键激素之一,具有重要的生理功能,在改善睡眠、调节生殖、延缓衰老等生理过程中起到不可或缺的作用,其功能机制研究亦较为成熟。本文综述了褪黑素和褪黑素受体的基本特征,特别关注褪黑素受体介导的信号转导特征;总结了其海洋生物中的褪黑素信号系统研究现状和面临的挑战,并对海洋生物开展该信号系统研究的理论价值及应用前景进行展望,以期为进一步探明海洋鱼类及无脊椎动物中褪黑素及其受体的信号转导特征和生理功能提供一定的线索,为褪黑素信号系统进化演变的探讨提供一定的理论参考。     

在海洋环境中的酵母菌分布与多样性

最近几年作者对不同海洋环境中的酵母资源、分布和多样性进行的大量研究,从中发现了22属63种1051株。并且发现这些广泛分布在海水、海泥、高盐海水、深海、各种大型海藻表面、各种海鱼体表和体内和红树林生态系统中。不同种的酵母可以产生蛋白酶、脂酶、植酸酶、菊糖酶、纤维素酶、β-1,3-葡聚酶、嗜杀因子、核黄素、铁载体等活性产物,所以这些酵母菌具有广泛的实际用途。     

溱潼凹陷阜一段层序地层格架及沉积体系研究

溱潼凹陷属走滑伸展型断陷,应用层序地层学原理和方法,建立了阜一段的层序地层格架,并在阜一段识别出湖泊三角洲和湖泊两大沉积体系。同时结合含砂率与地震属性研究,恢复了阜一段低位域、湖扩域和高位域的沉积体系,认为各体系域沉积体系在时空展布上具有一定的继承性和差异性。综合分析认为,研究区阜一段东部的殷庄—广山地区在低位域时发育大型三角洲沉积体系,主要以前缘河口坝及席状砂沉积为主,可作为良好储集层;西部斜坡带华港—北汉庄地区,低位域及高位域均发育三角洲沉积体系且规模较大,主要为平原河道及前缘河口坝沉积,也可作为很好的油气储层。     

玉米栽培研究中的数据库管理系统应用程序

本系统是为玉米高产、稳产栽培试验研究而编制的。作者着重介绍数据库管理系统与应用程序包之间交互作用,数据库的条件检索方法以及整个系统的结构和功能。研究过程中证实,使用本系统大大提高了工作效率。