九孔鲍养殖中的脓疱病病因分析和药物敏感性研究

在福建沿海养殖的九孔鲍不论是成鲍还是幼鲍均经常发生脓疱病,死亡率可达 50％-60％,其症状与皱纹盘鲍脓疱病相似,但对药物的敏感性却不同．研究发现: 导致福建省的九孔鲍发生脓疱病的主要致病菌为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)而非 河流弧菌(V．fluvialis)．其对多数药物不敏感,在43种抗菌药物中只对呋喃妥因、氯霉 素、痢特灵等中度敏感,而对青霉素、复方新诺明和头孢类药物则完全不敏感．由于上述 药物已被列为禁用渔药而不宜使用,故生产中应以新研制的无公害防治药物替代．     

皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究

于１９９３－１９９５年，用免疫法防治皱纹盘鲍脓疱病，河流弧菌－ＩＩ分离自大连水产养殖公司，太平洋海珍品养殖公司的患脓疱病的皱纹盘鲍；健康皱纹盘鲍，由大连水产养殖公司石庙苗种厂提供，鲍血淋巴细胞的体外培养吞噬实验，取健康皱纹盘鲍的血淋巴与肝素和菌液铵一定比例混合后，置湿盒内３７℃培养３０ｍｉｎ，取一滴涂片，吕氏液染色后观察，用该病原菌制做菌苗，大量扩增病原菌，用０．１％－１．０％的甲醛洗下菌苔，处理     

皱纹盘鲍脓疱病病原菌—河流弧菌—Ⅱ的抗药机制的实研究

１９９３年９月至１９９５年末，大连地区的一龄鲍至成鲍都出现了脓疱病，用常规方法从３个养殖厂的病鲍中分离到了３个菌株，分别为Ｄ株、Ｎ株和Ｔ株。经鉴定这３个菌株为同一种－河流弧菌－Ⅱ。     

皱纹盘鲍对河流弧菌-Ⅱ苗免疫的研究

于1993-1995年，用免疫法防治皱纹盘鲍脓疱病。河流弧菌-Ⅱ分离自大连水产养殖公司、太平洋海珍品养殖公司的患脓疱病的皱纹盘鲍;健康皱纹盘鲍，由大连水产养殖公司石庙苗种厂提供。鲍血淋巴细胞的体外吞噬实验:取健康皱纹盘鲍的血淋巴与肝素和菌液按一定比例混合后，置湿盒内37℃培养30min，取一滴涂片，吕氏液染色后观察。用该病原菌制做菌苗，大量扩增病原菌，用0.1％-1.0％的甲醛洗下菌苔，处理24-120h，用生理盐水反复清洗，除掉甲醛;再用生理盐水稀释到所需浓度。通过反复传代降低毒性，制成活菌苗。用两种菌苗在稚鲍、一龄鲍（2-3cm）和成鲍（6-8cm）上实验。结果表明，鲍的血淋巴细胞约有三种，三种细胞都有吞噬细菌的能力，有的细胞象变形虫样变形，在细胞膜上吸附着很多细菌，有的细菌已被吞到细胞内;该病原菌可同鲍的血清发生凝集反应;菌苗的效果明显，可提高成活率约50％以上。由上述结果可见，皱纹盘鲍的血淋巴细胞具有吞噬细菌的能力，在菌苗的作用下，血淋巴细胞增殖并活跃地吞噬异源致病菌，同时鲍血液中的免疫因子也被激活，参与免疫的过程，使皱纹盘鲍成活率明显提高。     

东山九孔鲍细菌性疾病研究

本文分离纯化了1999年春东山县患病九孔鲍的2株主要病原菌，进行了回归感染、药敏试验、病变组织的超薄切片观察。结果表明此次暴发性流行鲍病的致病菌主要是溶藻弧菌和副溶血弧菌。在所进行的48种药物的药敏试验中，2株菌仅对氯霉素和复方新诺明等8种药物共同敏感，药物联合抗菌试验还表明复方新诺明与磺胺甲基异恶唑等有协同作用，氯霉素与复方新诺明等有加成作用。     

杂色鲍Haliotis diversicolor溃疡症病原菌的研究

从患病杂色鲍Haliotisdiversicolor病灶上以TCBS及 2 2 1 6E平板划线各分离到两株致病性细菌 ,经人工感染实验可出现与自然发病相同的症状 ,并从感染鲍分离到同一菌株 ,证明该两株菌为杂色鲍溃疡症的病原菌。这两株菌的特征具明显一致性 :革兰氏阴性 ,短杆状 ,极生单鞭毛。氧化酶和过氧化氢酶阳性 ,淀粉酶、明胶酶阳性及脲酶阴性 ,可还原硝酸盐 ,不能利用柠檬酸 ,不产生吲哚和硫化氢 ,MR阳性、V .P实验阴性 ,发酵葡萄糖产酸不产气 ,O/ 1 2 9敏感 ,0 %和 1 0 %胰胨水中不生长。经鉴定该病原菌为亮弧菌ⅡVib riosplendidus-Ⅱ。还对亮弧菌进行了药敏试验 ,该菌对氨苄青霉素、氯霉素、复方新诺明等药物非常敏感 ,这些药物可作为防治该病的首选药物     

脱壳病和吻肿病东风螺体内致病菌及条件致病菌菌相研究

为探讨东风螺脱壳病和吻肿病与体内外致病菌及条件致病菌的相关性,测定了东风螺养殖水体环境中异养菌菌落总数,并对病螺及健康螺体内致病菌及条件致病菌进行了分离鉴定.经兔血培养基、TCBS培养基和弧菌显色培养基分离培养,用生化试验和细菌16S rDNA序列分析鉴定,结果显示:发生脱壳病的方斑东风螺螺池水体中的异养菌菌落总数为1.34×106 cfu/mL,病螺体内分离的致病菌及条件致病菌有副溶血弧菌、哈氏弧菌、河流弧菌、Vibrio hepatarius、腐败希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽孢杆菌,其中优势菌株为副溶血性弧菌溶血菌株和哈氏弧菌;脱壳病与吻肿病共患的泥螺螺池水体中异养菌的菌落总数为1.46×107 cfu/mL,病螺体内分离的致病菌及条件致病菌有副溶血弧菌、哈氏弧菌、鲍鱼希瓦氏菌、海藻希瓦氏菌和芽胞杆菌,优势菌株为海藻希瓦氏菌、鲍鱼希瓦氏菌和哈氏弧菌;健康东风螺螺池水体异养菌菌落总数为7.6×104 cfu/mL,健康东风螺螺体内的优势菌株为副溶血性弧菌非溶血菌株和Vibrio hepatarius.试验结果表明,东风螺脱壳病和吻肿病与养殖水体环境中异养菌的总数及螺体内部致病菌及条件致病菌分布具有一定相关性.     

工厂化养殖杂色鲍致病菌副溶血弧菌的分离鉴定及其生理特性

从广东汕尾地区工厂化养殖的患病和死亡的杂色鲍(Haliotis diversicolor)及养殖海水中分离到3株优势菌,经回归感染试验,证实所分离的细菌为杂色鲍的致病菌。经形态、生理、生化等多项指标鉴定,该菌株为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),并经ATB微生物自动鉴定系统证实鉴定结果。在中国大陆,由副溶血弧菌使杂色鲍致病并大量死亡的事件,本文属首次报道。     

粤东养殖区分离的2株海洋弧菌及其胞外产物对皱纹盘鲍致死毒性的初步分析

2011年秋,福建和广东地区养殖的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)相继暴发死亡。同年12月,我们从广东汕头病区取样分离得到2株弧菌,其中bb3为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus), bb4为哈氏弧菌(V. harveyi)。本研究以bb3、bb4作为供试菌株对1龄皱纹盘鲍进行侵染实验,获得如下结果：20℃条件下,供试菌及其胞外产物粗提液注射处理均可致受试鲍死亡,浓度2.5×107 cfu/mL 的 bb3与2.0×107cfu/mL的bb4悬液注射可分别引发43.33%和78.02%的受试鲍死亡;供试菌株的致死毒性与注射弧菌的总量正相关,与受试幼鲍的壳长、全湿重负相关;注射或浸泡-创伤两种处理方式均可导致受试鲍死亡,并且因注射供试弧菌而死亡的幼鲍软体部组织被健康鲍取食后也可引发取食者死亡;从侵染实验死亡的受试鲍软体部组织中可重新分离得到这2种供试弧菌。上述结果表明,溶藻弧菌 bb3和哈氏弧菌bb4是皱纹盘鲍的病原菌。药敏试验表明, bb3、bb4均已对抗生素具有一定程度的耐药性,在测试的20种抗生素中,仅有头孢曲松和丁胺卡那霉素是这2株弧菌同时高度敏感的抗生素,但bb3和bb4却对8种抗生素同时表现出抗性。     

皱纹盘鲍脓疱病的防治方法初探

近年来，皱纹盘鲍（Ｈａｌｉｏｔｉｓｄｉｓｃｕｓｈａｎｎａｉ　Ｉｎｏ）海水养殖在我国北方沿海地区得到了迅速的发展。同时，在人工养鲍过程中也出现了多种疾病。已报道的有细菌病、真菌病、派金虫病、才女虫病、寄生虫病和气泡病等［１，２］。大连地区在室内槽式养殖皱纹盘鲍过程中，连续发生脓疱病暴发现象，死亡率高达５０～６０％；夏季连续高温季节发病频繁，持续时间长，死亡率更高，造成的经济损失极其严重。有关鲍的脓疱病，国内尚无报告。孙振兴等人曾报告近年来发现鲍的足部溃疡症［３］，其症状与本文报告的脓疱病症状有些方…     

一株副溶血弧菌噬菌体VPp1 的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)的生物防治方法,从水产品市场处污水中分离出一株副溶血弧菌噬菌体 VPp1.并借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,同时测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线以研究其裂解性能.分类鉴定结果表明,其核酸是线型双链DNA,大小在15 kb 左右.具有一个正二十面体的头部,头部直径大约为44 nm,无尾,属盖噬菌体科(Tectivirus);裂解性能研究结果表明,其在双层平板上培养12 h 可形成中心清亮的噬菌斑,周围有大而明显的晕环.最佳感染复数为0.0001,潜伏期为10 min,裂解量为90.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的理想噬菌体,可用作进一步的应用.     

河流弧菌对牙鲆表皮黏液黏附作用的研究

为了解河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附特性,采用3H-TdR同位素示踪方法研究了细菌浓度、孵育时间、孵育温度、pH值、阳离子、碳水化合物等因子对河流弧菌黏附作用的影响。试验结果表明:河流弧菌能很好地黏附于牙鲆表皮黏液,黏附量随菌浓度升高而增大并符合饱和黏附动力学:y=417.89ln(x)+691.57(R2=0.986);在30℃下黏附量随着孵育时间的延长而增加,180min趋于饱和;孵育温度在4~30℃范围内黏附量随温度升高而增多,30℃时黏附量最大;pH值酸性较碱性黏附作用明显,pH为5时最强;NaCl浓度在0.5%~4.5%范围内,细菌黏附作用随着浓度升高而增强,较纯水存在显著性差异(P<0.05);Ca2+,Mg2+能显著加强河流弧菌的黏附作用,但Ca2+作用明显超过Mg2+;葡萄糖等8种碳水化合物能显著促进河流弧菌的黏附作用(P<0.05)。以上结果说明:河流弧菌对牙鲆表皮黏液的黏附量较大,这有利于进一步感染、致病;河流弧菌的黏附作用受温度、pH值、阳离子、碳水化合物等多种环境因子的影响,较高的水温有利于河流弧菌的黏附,有利于疾病的发生。     

皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道潜在益生菌的筛选及对幼鲍生长的影响

采用体外实验筛选益生菌结合16SrDNA序列分析法,从124株不具有溶血作用的皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肠道细菌中筛选得到5株潜在益生菌并进行了分子鉴定,进一步对5株潜在益生菌进行了安全性实验及体内饲喂实验。结果表明,2株具有拮抗哈维弧菌和灿烂弧菌能力的潜在益生菌分别被鉴定为Shewanella sp.(WA64)和Shewanella sp.(WA65),一株产海藻酸酶和淀粉酶的潜在益生菌被鉴定为Vibrio sp.(WA51),产蛋白酶潜在益生菌被鉴定为Bacillus sp.(FA12),产琼脂酶潜在益生菌被鉴定为Tamlana sp.(FA86);安全性实验表明5株潜在益生菌在107cfu/ml下对皱纹盘鲍没有明显的毒害作用;通过体内饲喂实验发现,潜在益生菌WA64、WA65的复合作用能够显著提高幼鲍增重率和存活率(P<0.05),并在生产条件下能够明显降低幼鲍的死亡量。经抗生素敏感性实验,WA64菌株对15种抗生素均敏感或中度敏感,WA65菌株仅对庆大霉素和链霉素2种抗生素产生耐药。     

绿色荧光蛋白标记的病原性河流弧菌在青石斑肠道的黏附定植研究

通过灌胃将绿色荧光蛋白标记的病原性河流弧菌导入青石斑鱼消化道内,追踪标记菌在青石斑肠道中的黏附和定植及对肠道消化酶活性的影响。结果表明,青石斑前肠和中肠在河流弧菌灌胃12 h即可检出,前肠在24 h达到峰值,大约为7.1×105 cfu/g,中肠则在36 h达到峰值,约为5.39×105 cfu/g,而后肠则是在24 h才开始检出,且检出时即达到峰值,但仅为2.44×104 cfu/g,说明青石斑鱼的前肠和中肠都是河流弧菌的主要黏附部位。灌胃96 h后前肠和中肠仍有标记菌存在,但在后肠已检测不到标记菌,反映出标记菌已在前肠和中肠定植下来,但没有在后肠定植。此外,标记河流弧菌的定植能够显著降低前肠蛋白酶活性和淀粉酶活性以及后肠脂肪酶活性。研究结果说明,病原性河流弧菌可通过黏附定植于鱼类肠道影响鱼类肠道消化酶活力,这可能是病原性河流弧菌引发鱼类病害的原因之一。     

海洋枯草芽孢杆菌HS-A38 产直链脂肽活性物质的初步检测

从海参肠道中分离得到了一株海洋枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HS-A38, 将其发酵上清液经盐酸沉淀、有机溶剂萃取得到具有广谱抗菌活性的代谢物质。采用薄层层析和茚三酮显色检测到4 种物质, 分别命名为化合物1、2、3 和4; 应用层析板覆盖指示菌的生物自显影技术对其抗菌活性成分进行追踪、检测, 结果发现化合物1 和2 具有显著抑制弧菌的作用。进一步检测分析表明, 化合物1、2和4 具有很强的热稳定性, 初步推断它们属于直链的脂肽类化合物, 并且这4 种物质出现在不同的发酵代谢时期, 这将为研究群体效应提供基础检测依据。     

A microsatellite panel for triploid verification in the abalone Haliotis midae

A method for ploidy verification of triploid and diploid Haliotis midae was developed using molecular microsatellite markers. In all, 30 microsatellite loci were tested in control populations. A final micro satellite multiplex consisting of seven markers were optimised and a complete protocol is reported. This protocol was successfully applied in identifying the ploidy levels of 42 ploidy-unknown abalone, showing the utility of microsatellite markers as tools for verifying the ploidy of individual abalone. The protocol can be applied in larger animals for which the isolation of nuclei and metaphase chromosomes from tissues is difficult.     

哈维弧菌和鲍类疱疹病毒刺激对杂色鲍免疫相关因子的影响

以哈维弧菌(Vibrio harveyi)、鲍类疱疹病毒(Abalone herpesvirus,Ab HV)悬液对杂色鲍(Haliotis diversicolor)注射刺激,研究其血淋巴中可溶性总蛋白浓度,免疫相关酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、酸性磷酸酶(Acid Phosphatase,ACP)、碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase,AKP)活性的变化,杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺、腹足中血蓝蛋白(Hemocyanin,Hc)基因Hc1、Hc2相对表达量的变化以及感染后杂色鲍无细胞血浆的抑菌性。结果显示:(1)杂色鲍血淋巴中可溶性总蛋白浓度变化显著,呈现出先升高后降低的趋势。(2)无细胞血浆中的SOD、ACP、AKP活性与对照组相比变化显著,哈维弧菌注射组的SOD活性在感染后第6小时显著升高;Ab HV注射组SOD活性与对照组比较在注射后的各个时相均呈下降趋势,从注射后6 h各个时相的SOD活性与对照组相比均差异显著(P0.05)。哈维弧菌注射组ACP活性在注射后的第48小时显著升高;Ab HV注射组ACP活性在注射后的第12小时显著升高。哈维弧菌注射组AKP活性在注射后48 h显著升高;AbHV注射组AKP活性在注射后第12小时显著升高。(3)杂色鲍外套膜、鳃、肝胰腺以及腹足中血蓝蛋白两个基因Hc1、Hc2的相对表达量均在注射后的不同时间点出现升高。(4)杂色鲍无细胞血淋巴对哈维弧菌、创伤弧菌和溶珊瑚弧菌这三种贝类病原均表现出了不同程度的抑菌性增强的作用。这些结果表明细菌和病毒的刺激引起了杂色鲍免疫相关因子的变化,使得血淋巴的抑菌性增强。本研究为今后进一步研究杂色鲍的非特异性免疫以及在生产实践中应用免疫技术防治病害提供参考。     

基于16S rDNA和看家基因序列分析技术的鲍鱼养殖水体弧菌种类的鉴定

采用TCBS选择性培养基从厦门某鲍鱼养殖场的养殖水体中分离到19株细菌.经16S rDNA序列分析,所有菌株均属于弧菌属（Vibrio）,且与最近似的弧菌模式种的同源性都在98.99%以上.由于弧菌种间16S rDNA序列相似度极高,无法仅靠16S rDNA序列比对来鉴定这些菌株到种的水平.16S rDNA序列的系统发育分析也显示,大多数菌株与弧菌模式种无法归为一簇,表明16S rDNA基因在弧菌种的分类鉴定上分辨率不高.进一步采用基于4种看家基因（rpo A、pyr H、gap A和top A）的多位点序列分析技术（MLSA）对分离到的弧菌菌株进行分类鉴定,结果显示19株海洋弧菌归于溶藻弧菌（Vibrio alginalyticus）与魔鬼弧菌（Vibrio diabolicus）2个种,表明这两种弧菌是该鲍鱼养殖场水体环境中的优势弧菌种,在鲍鱼养殖弧菌病害防治方面需要重点关注.此外,看家基因与16S rDNA基因的多态性分析表明,4种看家基因的多态位点比率均高于16S rDNA.4种看家基因串联后的多态位点比率高达41.1%,远高于16S r DNA基因的13.4%,表明看家基因相较于16S rDNA基因有着更高的分辨率,更适合于海洋弧菌的分类鉴定.