不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的ITS2分析

采用分子生物学方法,进行了江苏和广西两个地区不同花纹文蛤群体的核糖体DNA转录间隔区(ITS2)的序列分析研究。结果表明,广西的文蛤群体和江苏的群体相比较,仅发现江苏群体在333—336bp处发生了缺失,江苏群体内不同花纹文蛤个体间的ITS2也发生了变化。聚类分析结果证实了序列分析结果,广西文蛤群体和江苏文蛤群体间发生了遗传变异,江苏文蛤群体内部也发生了遗传分化。     

不同花纹文蛤(Meretrix meretrix)的外套膜蛋白质的双向电泳研究

采用双向电泳技术,对浙江乐清无花纹和有花纹文蛤外套膜的全蛋白进行了研究,并利用质谱和软件对差异蛋白进行了分析。经PDQuest软件分析,在pH4—7,分子量14.3—200kD之间,无花纹文蛤样品中检测到682±24个蛋白质点,有花纹样品检测到600±35个蛋白质点,平均匹配率为84.5%。研究结果显示,两种文蛤共有256个点存在差异表达,这些差异点可能与贝壳的颜色和花纹形成有关。其中98个点为无花纹文蛤特有,57个点为有花纹文蛤特有,另有101个点在表达量上存在两倍以上差异。在无花纹贝壳中发现分子量为42kD左右,等电点为6.4左右,与库蚊的肌动蛋白(分子量为41.7kD,等电点为5.3)匹配率较高;分子量为29kD,等电点为5.6,与飞鱿的肌动蛋白(分子量为29kD,等电点为5.25)匹配率较高的两个蛋白质。在有花纹文蛤中发现了分子量为27kD左右,等电点为4.8,与丽文蛤属的肌浆钙结合蛋白(分子量为20.8kD,等电点为4.98)匹配率较高。     

文蛤(Meretrix meretrix)幼虫发育过程中细胞凋亡和Caspase 功能分析

以文蛤为研究对象,利用TUNEL技术(Terminal-deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP Nick End Labeling)检测了文蛤各发育阶段的幼虫中细胞凋亡的部位,利用Caspase原位标记分析了有活性的Caspase在幼虫中的分布情况,用Caspase抑制剂Z-VAD-FMK处理受精后4天和5天的变态前幼虫,同时以抑制剂的有机溶剂DMSO(Dimethyl sulfoxide)作对照,根据其对幼虫变态的影响,分析Caspase在文蛤幼虫变态中的作用.细胞凋亡检测结果显示,幼虫发育过程中发生细胞凋亡的部位主要在壳顶幼虫的面盘,说明细胞凋亡可能是文蛤幼虫变态过程中面盘退化的主要机制;在担轮幼虫至壳顶幼虫中都检测到有活性的Caspase,说明整个幼虫形态变化过程中都有Caspase的参与;用Caspase特异性抑制剂处理变态前幼虫,发现处理组幼虫变态率均显著低于对照组(P<0.05),说明Caspase在变态早期和晚期都有重要作用,同时发现DMSO对幼虫变态有诱导作用,可以在生产中加以利用.     

缢蛏(Sinonovacula constricta)重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白的性质解析

利用缢蛏(Sinonovacula constricta)重组铁蛋白富集Fe~(3+)和Mn~(2+)制备重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白,通过扫描电镜、X射线能量色散能谱仪(EDS)和MALDI TOF/TOF质谱系统测定蛋白的表面形貌变化、金属元素的能量变化和肽段分子量。利用综合物性测量系统(PPMS)测定蛋白纳米颗粒在室温300K,外加磁场3T下的磁学性质变化。结果显示,重组Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白与空白相比,表面形貌发生明显变化,Fe-铁蛋白仍为小球状,Mn-铁蛋白聚集体呈片层花球状,Cd-铁蛋白聚集体呈小圆球状,Mn-铁蛋白富集Cd~(2+)后呈片层花瓣散落状。Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白分别检测出相应金属元素且都有其特征能量态。两种重组蛋白的肽谱图与空白组相比,除铁蛋白保守肽段外还出现各自的特征肽段,推测与铁蛋白对Fe~(3+)和Mn~(2+)的富集功能密切相关。Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白纳米颗粒磁滞回线形状与铁蛋白空白组基本相同,呈顺磁性特征,磁性强度随Fe~(3+)和Mn~(2+)富集量的增加而增大。通过比较Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白与空白组在富集Hg~(2+)、As O43–和Cd~(2+)三种重金属离子方面能力的差异,发现Fe-铁蛋白对Hg~(2+)、AsO_4~(3–)和Cd~(2+)三种重金属的富集能力是空白组的2.4倍、1.7倍和3.7倍。Mn-铁蛋白对Hg~(2+)、AsO_4~(3–)和Cd~(2+)三种重金属离子在相同条件下的富集能力也有明显提高,分别为铁蛋白空白组的1.8倍、3.0倍和4.6倍。本研究结果为Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白在重金属污染治理方面的应用提供了数据参考。     

不同盐度对文蛤(Meretrix meretrix)呼吸代谢及体内酶活性的影响

为研究不同盐度对文蛤呼吸代谢的影响,本实验设置5个盐度(‰)梯度(11、18、25、32、39),检测不同盐度对文蛤(Meretrixmeretrix)耗氧和排氨的影响,以及文蛤的外套膜、鳃、肝胰腺三种组织中乳酸脱氢酶和Na+/K+-ATP酶活性的变化。结果表明:随着盐度的不断升高,文蛤耗氧率先升后降再升,在盐度18时达到最大值;排氨率先升后降,在盐度32时达到最大值。随着盐度不断升高和胁迫时间延长,文蛤的肝胰腺中乳酸脱氢酶活力总体呈先升高后下降再升高的趋势(P0.05),酶活力在盐度39时为最高;随着盐度不断升高和胁迫时间延长,文蛤的外套膜中Na+/K+-ATP酶活力总体呈先下降再升高后下降的趋势(P0.05),在盐度32时为最高;文蛤的外套膜和鳃中乳酸脱氢酶活力以及鳃和肝胰腺中Na+/K+-ATP酶活力受盐度影响不显著(P0.05),酶活力变化也多呈现"W"形的变化趋势。研究结果为文蛤的人工养殖提供参考。     

泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集重金属离子的特性及化学传感器的研究

利用泥蚶(Tegillarca granosa)铁蛋白原核表达工程菌获得的重组铁蛋白,通过圆二色光谱分析蛋白二级结构,扫描电镜和电感耦合等离子质谱研究重组铁蛋白富集Fe~(2+)、Mn~(2+)、Cd~(2+)、Cr~(3+)、Hg~(2+)、Pb~(2+)和As~(3+)等7种重金属离子的特性,同时探索利用重组铁蛋白修饰丝网印刷电极,设计和制备重组铁蛋白检测Pb~(2+)和Cd~(2+)浓度的电化学生物传感器。结果表明复性成功的铁蛋白多为完整的?-螺旋结构,而复性不成功的蛋白聚集体则多为无规卷曲。重组铁蛋白的直径和形态与富集的离子种类有关。泥蚶铁蛋白对单一金属离子Fe~(2+)和Mn~(2+)的富集凸显优势。对两种混合金属离子的富集大多表现为竞争关系。但重组铁蛋白对Hg~(2+)和As~(3+)混合组的富集量明显高于单一金属离子组的富集量,对Hg~(2+)和As~(3+)混合组的富集表现出协同促进作用。重组铁蛋白传感器对Pb~(2+)和Cd~(2+)溶液的最低检测限为10μg/L。     

广西文蛤(Meretrix)的fAFLP 及ITS 分析

利用fAFLP标记技术和PCR-RFLP技术,对采集于广西的形态和壳色变异很大的2个文蛤群体(G、W)以及山东文蛤(S)群体进行了遗传结构和亲缘关系研究.fAFLP分析显示:在457个总扩增位点中存在53个W群体的特异性位点(其中9个为100%显性)、21个G群体的特异性位点、14个S群体的特异性位点,这些位点可作为群体鉴别的特征性标记;通过计算群体间相对遗传距离和聚类分析,发现S和G间的遗传距离最小(0.0424),在系统树上首先聚在一起,而W与S、G的相对遗传距离均很大(0.2308和0.2305),单独分出一支.对文蛤核糖体ITS的PCR-RFLP结果显示:W的三个不同壳色类群(WX、WC、WH)的酶切结果完全一致,而与G和S群体差别较大;G和S群体基本一致,但也稍有差别.进一步的ITS序列分析显示:W的ITS序列长度为1266-1269bp.而G和S分别为1614bp和1520bp;W群体内部序列比较保守,而与G和S群体之间在ITSl和ITS2开始和结尾处均存在多处插入/缺失;在依据序列构建的系统树上,WX、WC、WH三个类群聚在一起,S和G聚为另一支,两支相距甚远.本研究结果表明,fAFLP标记分析、PCR-RFLP分析和ITS序列分析结果一致,W群体和G、S群体的差异较大,已超出种内群体间的遗传变异,S和G尽管存在遗传分化,但仍应同属Meretrix meretrix-个物种.     

泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集锰铁后的磁学性质解析

利用埋栖性双壳类生物泥蚶(Tegillarca granosa)重组铁蛋白富集锰铁的性质,在不同锰铁浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒,通过扫描电镜观察高、中和低三个浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的表面形貌,通过PPMS综合物性测量系统测定Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的磁学性质。结果显示,在低浓度(0.1mmol/L)锰铁制备的Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒粒径均一,分散性好;发现Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白的磁滞回线均表现为超顺磁性,且随着重组铁蛋白对锰铁富集量的增加,磁性强度随之增大,增加速率逐渐减小。通过本实验探索高、中和低三个浓度下制备Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的磁化强度变化规律,为Fe-铁蛋白和Mn-铁蛋白磁性纳米颗粒的应用提供数据支持。     

文蛤属(Meretrix)16S rRNA基因及ITS1序列的系统学分析

利用线粒体16SrRNA基因片段及核糖体DNA转录间隔区ITS1序列分析的方法,以近缘属的青蛤(Cyclinasinensis)为外群,对文蛤属的文蛤(M.meretrix)、丽文蛤(M.lusoria)、帘文蛤(M.lyrata)和斧文蛤(M.lamarckii)4种贝类进行了系统学研究。经ClustalX多重比对及DNAsp软件分析后,用PAUP4.0分析软件,计算出种间序列的碱基转换/颠换频率,利用邻接法NJ构建系统发育树。结果表明,帘文蛤与该属其他三种的分歧时间较早,两类序列与其他种类间的相对遗传距离分别在0.25866—0.28218和0.15644—0.20104之间。文蛤与丽文蛤间的16SrDNA及ITS1序列间的遗传距离仅为0.04805和0.04201,拓扑结构图显示关系很近,并且二者的分布区大面积重叠,其序列间的转换/颠换频率接近种内单元型(haplotype)间的序列变化,鉴于它们的贝壳形态有一定差别,应归为同一个种内的不同地理亚种比较恰当。     

可口革囊星虫(Phascolosoma esculenta)重组铁蛋白富集Pb2+等重金属特性和功能研究

利用可口革囊星虫重组铁蛋白富集Pb²⁺、Fe³⁺、Cd²⁺、Cr³⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Sn²⁺和Zn²⁺等8 种重金属离子后, 通过透射显微镜和傅里叶红外光谱测定蛋白的超微结构变化和内部基团特性。以 天然的马脾铁蛋白为对照, 观察重组铁蛋白与天然铁蛋白的差别。结果显示, 重组铁蛋白富集Pb²⁺ 和其它7 种重金属离子后蛋白体积大小与重金属离子种类直接相关。重组铁蛋白相对天然铁蛋白来 说在富集不同种类重金属离子后, 除了非特异性酰胺特征峰和蛋白特征峰外, 还出现一些专门富集 某些重金属离子的特异基团, 如:-CH₃、-CH₂-、-CH-、-NH-、-SO₃-、-COOH、-S=S-和-C-S-C 等。 通过细胞实验进一步验证了铁结合蛋白能够通过富集重金属离子Pb²⁺来保护小鼠成骨前体细胞 MRC3T3-E1, 使细胞的死亡率明显降低(P<0.05).     

文蛤(Meretrix meretrix)C-型凝集素基因的分子克隆及表达分析

C-型凝集素是一种重要的模式识别蛋白,本研究以文蛤为材料。利用PCR扩增和RACE技术首次获得了编码文蛤C-型凝集素的基因(Mm-CTL)c DNA序列,全长为1855bp,其开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。Smart软件预测Mm-CTL的糖识别结构域(CRD)从第34个氨基酸到第168个氨基酸。BLASTP序列相似性分析显示,Mm-CTL与大竹蛏氨基酸序列同源性最高,相似性为56.5%,与其它无脊椎动物的相似性为13.5%—23.9%。系统进化树分析与同源分析结果一致,其中Mm-CTL与双壳类C-型凝集素聚在一起,与大竹蛏亲缘性最近。环境胁迫实验显示,溶藻弧菌感染6h时Mm-CTL表达量明显上升,在12h时达到最高值,随后有所下降。盐度胁迫时Mm-CTL在盐度5时表达量相对较低,在盐度10—20中的表达量相对较高。温度胁迫时Mm-CTL在35°C时表达量相对最高,10°C时表达量明显较低。研究结果表明,文蛤应对环境因子影响可通过调节Mm-CTL的表达来应答免疫反应。本研究将为贝类先天性免疫因子研究以及病害的防控奠定基础。     

文蛤(Meretrix meretrix)精子的超微结构及精子入卵过程的电镜观察

利用透射电镜和扫描电镜对文蛤精子的超微结构及精子入卵过程进行了详细观察。结果显示,文蛤精子为典型的原生型,由头部、中段和尾部三部分组成,全长45—50μm。头部呈狭茧形,长约3.0μm,由顶体和细胞核组成,顶体呈倒"V"字形,前端有短柱状的凸起;细胞核为稍弯曲的圆柱形,内含高度浓缩的染色质,无核前窝,有核后窝。中段较短,仅0.6—0.7μm,由线粒体围绕中心粒复合体构成,5个圆球形的线粒体呈单层梅花状排列,内部为双层膜折叠成的片层状结构;中心粒复合体由近端中心粒和远端中心粒组成,而远端中心粒延伸出尾鞭的轴丝。尾部为细丝状鞭毛,长约42—45μm,内部的轴丝呈典型的"9+2"结构,外周有波浪状质膜包被。用扫描电镜观察了文蛤精子的入卵过程,大致将其分为顶体反应期、穿卵期和卵膜修复期。受精后2min,精子发生顶体反应,顶体泡破裂释放溶解酶使卵膜变得疏松,亚顶体腔中伸出的顶体丝先穿透卵膜;受精后4—6min,在精、卵的共同作用下,精子头部和中段逐渐穿过卵膜进入卵内,在卵膜上形成一个直径约1.5μm的孔道,而精子尾部则留于卵外;受精后8—10min,精子尾部脱落,受精形成的孔道被卵膜的微绒毛修复。另外对多种双壳贝类精子超微结构和线粒体入卵等问题进行了探讨。     

我国沿海不同地理原种文蛤(Meretrix meretrix)的SRAP分析

采用序列相关扩增多态SRAP(Sequence-related amplified polymorphism)标记对国家级江苏文蛤良种场(筹)保存的广西北海(GX)、江苏南通(JS)、辽宁大连(LN)三个地理种群原种文蛤进行种质资源分析。结果表明:(1)15对引物在文蛤3种群共扩增223个位点,其中多态位点数为159个,多态性位点百分率为71.30%,显示了较高的多态性;(2)GX、JS、LN3种群的多态性位点百分率分别为69.12%、57.81%、51.85%,平均杂合度分别为0.2532、0.2162、0.1836,香农信息指数分别为0.3649、0.3127、0.2714,均以GX种群最高,表明GX种群遗传多样性更为丰富;(3)3种群扩增位点显性基因频率的分布规律揭示,与LN和JS两种群相比,GX种群中低频基因位点显著增加,而隐性纯合基因位点显著减少,表明GX种群中存在大量稀有等位基因。各地理种群原种文蛤遗传多样性水平相对较高,遗传改良潜力大,GX种群作为选择育种的基础群更为适合。     

文蛤（Meretrix meretrix）4个壳色花纹品系的遗传差异分析

应用AFLP技术对文蛤红壳（RS）、黑斑（BS）、细纹（TC）、暗纹（DF）4个壳色花纹品系进行遗传差异分析。利用15对AFLP引物组合对4品系共128个个体进行了PCR扩增和电泳检测,共得到789个位点,总多态位点比例90．75％。Nei’s基因多样性和Shannon’s信息指数显示,4个品系的遗传多样性大小,依次为...     

脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)ferritin 基因克隆及表达分析

采用RT-PCR及RACE技术获得了总长度为755bp的脊尾白虾ferritin基因cDNA序列。该基因序列5’和3’的非编码区分别为112bp和146bp,开放阅读框497bp,推测编码169个氨基酸,预测蛋白分子量19.1kDa,等电点5.46,该基因命名为Ecfer基因。利用Neighbor-joining法构建系统进化树分析结果表明,Ecfer基因氨基酸序列与无脊椎动物中的甲壳动物聚为一支(同源性为64%—67%)。此外,Ecfer基因氨基酸序列与脊椎动物铁蛋白H链同源性为53%—57%。采用荧光定量RT-PCR研究Ecfer基因在组织中以及经WSSV刺激后血淋巴、肝胰腺中的表达变化情况。研究结果表明,Ecfer在肝胰腺、卵巢、肌肉、鳃和血淋巴中均有分布。注射WSSV后3h和6h,肝胰腺和血淋巴Ecfer基因表达较对照组均显著上调(P<0.05),并具有显著的时间差异性。说明Ecfer基因可能参与了脊尾白虾抵抗WSSV入侵的免疫反应。     

南移养殖仿刺参（StichopusjaponicusSelenka）铁蛋白基因的克隆及表达特征分析

采用cDNA文库、RACE、荧光定量PCR和Westernblot技术,克隆了南移养殖仿刺参铁蛋白基因的全长序列,并对其表达特征进行了研究。结果表明,南移养殖仿刺参铁蛋白cDNA全长1222bp,包括187bp的5’UTR;513bp的3’UTR和编码173个氨基酸残基的522bp的开放阅读框。诸如铁结合序列标签和铁调...     

泥蚶(Tegillarca granosa) cDNA 文库的构建及铁结合蛋白基因(Ferritin)序列分析

取正常泥蚶肌肉组织获得总RNA,纯化mRNA后,利用含SfiⅠ酶切位点的CDSⅢ引物逆转录合成cDNA第一链,通过LD—PCR合成cDNA双链,经胶回收除去短片段,与pDNR—LIB载体进行连接,电转化到大肠杆菌DH10B中,构建形成原始文库,进行滴度测试和重组率鉴定。结果表明原始文库的滴度为3．17&#215;10^5cfu／ml,重组率为86．3％,插入片段多在500--2500bp间。随机挑选458个克隆测序,经分析获得94种已知基因及87种未知基因。其中包括铁结合蛋白（Ferritin）的全长cDNA序列。该基因序列全长895bp,5’-端非编码区为163bp,3’-非编码区为213bp,开放阅读框为519bp,编码172个氨基酸。推测其蛋白分子量和等电点分别为20kDa和4．89。氨基酸序列与皱纹盘鲍、太平洋牡蛎、血红扇头蜱、文昌鱼、中华蟾蜍、非洲爪蟾、小家鼠以及人等的同源性有62％-82％。比对结果表明,铁结合蛋白基因在动物进化中高度保守。     

红壳文蛤双列杂交及杂种优势分析

以广西(G)、江苏(S)和日本(J)3个文蛤群体中原种红壳文蛤进行双列杂交,获得了试验家系(Gg、Ss、Gs、Gj、Sg、Sj),比较其生长性能,并评估杂种优势。从生长来看,浮游期杂交组的日生长率大于自繁组;以江苏文蛤为母本的组合的壳长均显著大于以广西文蛤为母本的组合(P0.05),壳长受卵源影响极显著(P0.01)。稚贝和幼贝期,杂交组的日生长率均大于自繁组,杂交组合Gs的日生长率从13日龄至149日龄均最大;交配方式对壳长极显著影响(P0.01)。从存活率来看,杂交组的存活优势更明显,Gs的存活率几乎均最高。从杂种优势来看,杂交组从13日龄以后具明显的杂种优势,尤其是Gs在1—149日龄均呈正值。广西群体和江苏群体间建立了完全2×2双列杂交,中亲杂种优势一直大于0,且始终介于单亲杂种优势HGs和HSg之间。杂种优势潜力指数(hp)表明,1—5日龄的数值介于–1和1之间,未产生杂种衰退;13日龄后的数值均大于1,表明真正获得了杂种优势。杂种获得(hg)及13日龄后的超亲优势率均为正值,进一步说明壳长性状得到了明显改良。从壳色来看,子代的红壳个体占比为72.80%—76.49%,均得到明显提高。总之,杂交组合Gs的杂种优势最明显,为开展3个群体的杂交育种提供了参考依据。     

沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/氧化酶(RubisCO)(EC4.1.139)是光合细菌通过卡尔文循环固定二氧化碳的关键酶。本文采用PCR方法,从沼泽红假单胞菌株No.9中克隆到RubisCO基因(cbbM)序列(该序列已提交GenBank,登录号:GU061327)。采用同源建模法,建立了该RubisCO蛋白的三维结构模型,预测其活性位点。将cbbM基因亚克隆到表达载体pTV118N上,构建表达质粒pTV-CBBM,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得表达菌株BL21(DE3)/pTV-CBBM,该菌株经IPTG诱导表达后,进行SDS-PAGE检测。采用气相色谱法测定破菌上清中的RubisCO酶活。结果表明:①cbbM基因编码461个氨基酸,与沼泽红假单胞菌株DCP3和DH1的RubisCO蛋白序列相似性分别为98%和99%;②推测沼泽红假单胞菌No.9中RubisCO蛋白的活性中心由Asn112、Lys192、Asp194、Glu195、His288、Arg289、His322、Gly424、Ser369、Gly370和Gly394等氨基酸残基组成;③重组蛋白分子量约为50kDa左右,与预测相符;④破菌上清中的RubisCO酶比活高于原始菌株中的酶活,说明目的基因在大肠杆菌中得到了有效表达。