刺激隐核虫生活史的光镜观察

本文对寄生于海水硬骨鱼体表组织的纤毛虫刺激隐核虫(Cryptocaryonirritans)的生活史进行了描述。该寄生虫生活史分3个阶段,即滋养体,包囊体和幼虫。滋养体主要营寄生生活。成熟的滋养体离开宿主后,在数小时内就发育成包囊体。包囊体的特点是具多层结构的囊壁,而且此阶段虫体的繁殖方式为不等分裂。每个成熟的包囊平均可形成273±64个幼虫。由于囊壁坚硬,幼虫游离后,包囊壁仍保持原样。进入水体的幼虫游动极快,不摄食,一旦遇到合适的宿主即侵入,并在宿主体内发育成滋养体。文中还将结果与淡水多子小瓜虫生活史进行了比较。     

复方中草药对小丑鱼非特异性免疫、消化酶活性的影响及对刺激隐核虫杀灭效果分析

刺激隐核虫寄生感染引起的“白点病”不仅危害水族箱观赏鱼类,还会对水族馆大水体海水观赏鱼带来毁灭性打击,是海水观赏鱼养殖业危害最为严重的病害之一。本研究探讨了在基础饲料中添加不同剂量复方中草药“XCY-1”(苦参、地肤子、蛇床子、黄芪、甘草等按一定比例混合,超微粉碎后收集备用)对小丑鱼血清、肝脏中非特异性免疫指标和肠道消化酶活性指标变化及不同用药方式对防治刺激隐核虫病的效果。研究结果显示,投喂复方中草药“XCY-1”可使小丑鱼血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP),肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)活性均呈现先升后降趋势,第21 d各项非特异性免疫指标达到最高值,其中20 g/kg剂量组效果最好,能显著提高小丑鱼的免疫能力;肠道中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶在各取样点活性均高于对照组,20 g/kg剂量组在各取样点胰蛋白酶和AMS活性高于其他剂量组,20 g/kg和40 g/kg剂量组在各取样点LPS活性最高。复方中草药“XCY-1”药浴对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭结果显示:4 h内,50 mg/L药物浓度即对刺激隐核虫幼虫具有一定的杀灭效果,400 mg/L药物浓度即可杀灭全部幼虫;当药物浓度达到800 mg/L时,3 h内幼虫全部死亡。不同用药方式防治小丑鱼刺激隐核虫病:实验分为4组,A组20 g/kg剂量组,口服无药浴;B组20 g/kg剂量组,口服且同时按50 mg/L进行药浴;C组20 g/kg剂量组,口服且同时按100 mg/L进行药浴;D组为对照组,仅投喂基础饲料。结果显示:实验第6 d,A、B、C三个药物组与对照组的存活率分别为:51.1%、53.3%、57.7%、0,药物组存活率显著高于对照组(P＜0.05);三个药物处理组每片鳃上仅有0~2个滋养体,对照组每片鳃上滋养体数量是用药组65倍。综上所述,饲料中添加复方中草药“XCY-1”可以提升小丑鱼血清、肝脏非特异性免疫指标和肠道消化酶活性,对刺激隐核虫病起到积极的预防和治疗效果。20 g/kg剂量组、投喂时间14~21 d时效果最佳。该研究为开发无公害、环保型天然植物源杀虫药提供理论参考和技术支撑。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的抗菌和抗寄生虫活性分析

近年来,我国重要经济鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）遭受了严重的海水白点病的感染,造成了巨大的经济损失。海水白点病是由体外寄生虫刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染引起,不仅能引起被感染鱼类生理的破坏,还能够引发二次细菌感染。有报道指出一些抗菌肽（antimicrobial peptides）具有抗刺激隐核虫的活性。大黄鱼hepcidin-like（命名为Lc-HepL）是从刺激隐核虫感染大黄鱼后的比较转录组中挖掘到的一个差异表达基因。本研究中,在基因和蛋白水平上分析了该抗菌肽的生物活性。刺激隐核虫感染后,qRT-PCR检测到Lc-HepL在鳃、肌肉、肝脏、头肾、肠道和脾脏6种组织中显著上调,并且上调的时间点出现在幼虫感染阶段、滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段,结果显示Lc-HepL在抗刺激隐核虫和二次细菌感染的免疫反应中发挥重要作用。在体外成功诱导并纯化的重组Lc-HepL（rLc-HepL）对某些病原菌具有剂量和时间依赖性的强抗菌活性。本研究首次探究了rLc-HepL的抗刺激隐核虫活性,显微观察结果显示其能引起幼虫细胞膜破裂、内容物外泄,该结果首次提供了大黄鱼hepcidin-like具有强抗刺激隐核虫活性证据。研究数据表Lc-HepL很可能是大黄鱼抗刺激隐核虫感染的一种重要的先天免疫因子,具有应用到未来的药物中的潜力。     

海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)趋化性研究

应用本实验室建立的趋化模型对海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的趋化特性进行研究。结果显示, 刺激隐核虫幼虫在30min时趋化达到饱和, 在温度28℃时趋化率达到最高; 多种硬骨鱼的血清与粘液对刺激隐核虫的幼虫都有着强烈的吸引作用, 刺激隐核虫幼虫对碳水化合物、氨基酸等小分子物质没有趋化作用; 在组织匀浆液中, 刺激隐核虫幼虫对肌肉匀浆液有一定的趋化作用, 对肝、肠、胃的匀浆液都没有趋化作用; 感染后鱼类血清对刺激隐核虫的幼虫有着更加强烈的吸引作用(P<0.01); 18种中草药中的五倍子、大黄、槟榔、苦楝、虎杖、贯众等6种中药草对刺激隐核虫的幼虫有一定的驱虫作用。本文的研究结果有助于深化对刺激隐核虫致病性的认识并对“白点病”的防治有一定的参考价值。     

刺激隐核虫ADP/ATP 载体蛋白基因的克隆和分子特征分析

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是严重危害海水鱼类的寄生纤毛虫,为了对其进行分子水平的研究,采用SMART技术构建了刺激隐核虫滋养体期的cDNA文库,并随机挑取克隆做EST测序,获得大量克隆的基因。从中挑选ATP/ADP载体蛋白基因同源物(CiAAC)的克隆进一步测序获得全长的cDNA序列。该序列全长为1029bp,包含编码287个氨基酸的开放阅读框。用RT-PCR分析了其在刺激隐核虫各时期的表达情况,并应用生物信息学分析方法,对CiAAC基因进行不同物种的系统进化树分析、功能区分析、物理性质分析、疏水性分析、跨膜结构域预测、亚细胞定位、二级结构预测等等。结果表明:CiAAC蛋白在刺激隐核虫各时期均有表达;据预测,它为六次跨膜蛋白,与卵形肠虫(Nyctotherus ovalis)的ADP/ATP载体蛋白的同源性最高,相似性达65%;蛋白为疏水性,并定位于刺激隐核虫的细胞质中。随后实验中通过对基因的定点诱变,将纤毛虫的非通用密码进行改造后,构建了pGEX-4T-1/CiAAC表达载体。以上实验为病原生物刺激隐核虫CiAAC载体蛋白的研究及应用提供了基础资料。     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。     

基于羟基自由基高级氧化快速杀灭锥状斯氏藻孢囊的研究

随着船舶压载水的转运,我国面临严重的外来入侵生物风险,其中部分赤潮藻形成的孢囊可成为赤潮的"种源",严重危害近岸海洋环境,因而快速有效地杀灭赤潮藻孢囊至关重要。本文利用大气压强电离放电高效生成的羟基自由基（·OH）,对典型赤潮藻锥状斯氏藻孢囊进行杀灭研究。采用萌发实验、SYTOX Green荧光染色法确定·OH杀灭锥状斯氏藻孢囊的阈值和时间,扫描电子显微镜观察孢囊的形态变化。结果表明,·OH杀灭孢囊的CT阈值为0.49 mg·min/L,时间为10 s,·OH氧化降解孢囊体内叶绿素,破坏DNA,抑制萌发,具有其他方法无法比拟的优势。因此,·OH快速杀灭赤潮藻孢囊的新方法,对防控外来入侵生物引发的海洋赤潮灾害具有重要的作用。     

蝉花菌质(Isaria cicadae)对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼生长、免疫和肠道菌群的影响

试验目的旨在研究蝉花菌质(Isaria cicadae)对大黄鱼(Larimichthys crocea)幼鱼生长性能、抗氧化和免疫、肠道组织形态以及肠道菌群等方面的影响,为大黄鱼绿色饲料添加剂的开发和利用提供参考。将初始体重为(16.50±1.10) g的大黄鱼幼鱼随机分成4组,对照组(IC0)不添加蝉花菌质,试验组分别添加1%(IC1)、3%(IC3)和5%(IC5)的蝉花菌质。试验结果表明:试验组的增重率(WGR)和特定生长率(SGR)显著高于对照组(P<0.05)。IC3与IC5组的肝体比(HSI)显著低于对照组(P<0.05),与IC1组差异不显著(P>0.05)。IC5组脏体比(VSI)显著低于对照组,但与其他试验组之间差异不显著(P<0.05)。肌肉和全鱼体成分各组之间差异不显著(P>0.05)。试验组肝脏过氧化氢酶(CAT)和血清溶菌酶(LZM)的活性显著高于对照组(P<0.05),各试验组间无显著性差异(P>0.05)。对照组单根绒毛杯状细胞数量显著少于各试验组(P<0.05),各试验组间无显著性差异(P>0.05...     

虾青素对饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡(Anguilla rostrata)幼鱼生长性能、血清生化、肠道自由基水平及肠道菌群的影响

氧化应激是饲料组胺胁迫对鱼体产生危害的主要途径之一。研究具有强抗氧化能力的虾青素对美洲鳗鲡幼鱼饲料组胺胁迫的缓解效果, 对降低鱼类饲料源胁迫具有重要意义。将400尾初始体重为(25.01±0.17) g/尾的试验鱼随机分为4个处理组, 即对照组、H组、H+Ast4组和H+Ast8组, 分别饲喂基础饲料、高组胺饲料(662 mg/kg)及在高组胺饲料中添加4 mg/kg、8 mg/kg虾青素的试验饲料。结果显示: 与对照组相比, H组美洲鳗鲡幼鱼生长性能和血清非特异性免疫能力显著降低(P<0.05),肠道自由基水平显著升高(P<0.05),肠道有害菌群丰度升高; H+Ast组美洲鳗鲡幼鱼的生长性能、血清非特异性免疫能力显著高于H组(P<0.05),肠道自由基水平显著低于H组(P<0.05), 上述指标H+Ast组与对照组无显著差异(P>0.05)。H+Ast组肠道有益菌群丰度高于H组和对照组。可见, 添加4 mg/kg虾青素即可缓解饲料组胺胁迫导致的美洲鳗鲡幼鱼生长抑制, 提高血清非特异性免疫能力, 降低肠道自由基水平, 有益调节肠道菌群。添加8 mg/kg虾青素对美洲鳗鲡幼鱼上述指标无进一步的改善效果。研究结果可为虾青素缓解美洲鳗鲡饲料组胺胁迫及其在饲料中的推广应用提供参考。     

染料木黄酮对大菱鲆生长、消化酶活力和肠道组织结构的影响

以鱼粉为主要蛋白源配制了5种不同剂量的染料木黄酮(0、5、10、20、100mg·kg-1)的实验饲料,来研究其对大菱鲆生长、消化酶活力和肠道组织结构的影响。结果表明:饲料中添加不同剂量的染料木黄酮对大菱鲆幼鱼的存活、终末体重、特定生长率、饲料效率、摄食率以及肥满度、脏体比和肝体比均未产生显著影响(P0.05);饲料中添加染料木黄酮显著降低了鱼体粗蛋白和粗脂肪含量并显著提高了鱼体水分含量(P0.05),但对鱼体灰分含量无显著影响(P0.05);饲料中添加染料木黄酮显著降低了胃蛋白酶、胰蛋白酶和肠淀粉酶的活性(P0.05),但对肠蛋白酶和胃淀粉酶的活性未产生显著影响(P0.05);饲料中染料木黄酮的添加量达100mg/kg时会对鱼的肠道组织结构产生一定的破坏作用,而其他处理组间肠道组织结构没有明显的差异。实验结果表明,饲料中添加高剂量的染料木黄酮对大菱鲆的生长性能和消化吸收会造成一定的负面作用,使用大豆蛋白做蛋白源时,其含有的染料木黄酮的抗营养作用不可忽视。     

植物乳杆菌对凡纳滨对虾致病菌抑制及其对肠道菌群结构的影响

本研究以凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)为对象,通过琼脂扩散法、荧光染色法与分光光度法筛选出对凡纳滨对虾致病菌有抑制作用、对对虾肠黏液有黏附作用且对盐度有耐受性的3株菌(YRL45、KTP(C-2)、QL),经16S rDNA测序比对发现此3株菌均为植物乳杆菌。将其混合饲喂凡纳滨对虾4周,通过高通量测序研究虾肠道菌群变化。研究表明,混合植物乳杆菌的饲喂对凡纳滨对虾肠道菌群的α多样性无显著性影响,变形菌门和拟杆菌门为凡纳滨对虾肠道优势菌门,植物乳杆菌对凡纳滨对虾肠道中放线菌门的丰度有一定的提高。通过LEfSe分析,发现植物乳杆菌处理组中潜在致病菌发光杆菌属减少,而属于光合细菌的赤杆菌属有所增加。研究结果为益生菌在凡纳滨对虾的应用提供了一定的理论指导。     

褪黑激素对香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensis)性腺发育的影响及羟基吲哚-O-甲基转移酶(HIOMT)的测定

本文研究了去头术和外源褪黑激素对香港细首纽虫(Cephalothrix hongkongiensis)性腺发育的影响,并对褪黑激素合成酶HIOMT进行了Western blot测定和免疫组织化学定位。结果表明,去除头部可快速诱导香港细首纽虫的性腺发育,处理40天后配子完全成熟,而对照组(完整个体)在整个实验过程中均未发现性腺。这说明香港细首纽虫头部具有抑制性腺发育的物质(激素)。外源褪黑激素对香港细首纽虫的性腺发育有显著的抑制作用,并且随着浓度的升高,抑制作用增强。Western bolt结果显示,在38k Da处有阳性条带;免疫组织化学定位发现,脑神经节的几个神经细胞有阳性反应,说明香港细首纽虫的脑神经节中存在HIOMT,具有合成褪黑激素的功能。     

不同饲养方式对乌鳢(Ophiocephalus argus)肠道微生物群落结构差异及种类多样性的影响

以乌鳢(Ophiocephalus argus)为研究对象,采用不同日粮饲喂,试验W1组饲喂冰鲜鱼,试验W2组饲喂畜禽内脏。12周后,取肠道内容物,利用16S rDNA技术研究投喂不同饲粮的乌鳢肠道生物群落结构差异和微生物多样性,分别获得W1组和W2组乌鳢肠道细菌有效序列51124和39298条。结果分析表明;W1组和W2组物种注释(operational taxonomic unit,OTU)数目分别为2631和4114条,分类地位明确的细菌种类分别隶属5个属和49个属,W1组和W2组乌鳢肠道细菌种类差异很大。W1组乌鳢肠道细菌的优势类群是邻单胞菌属(Plesiomonas)、狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、鲸蜡菌属(Cetobacterium);W2组乌鳢肠道细菌的优势类群是狭义梭菌属(Clostridium sensu stricto)、邻单胞菌属(Plesiomonas)、Spartobacteria、甲基副球菌属(Methyloparacoccus)、杆菌属(Alsobacter)、Saccharibacteria、分支杆菌属(Mycobacterium)。W2组乌鳢肠道细菌香农指数高于W1组乌鳢肠道细菌,表明前者肠道细菌多样性大于后者。本实验揭示了畜禽内脏饲喂乌鳢肠道细菌的群落种类多样性、OTU丰富度和物种总数均高于冰鲜鱼饲喂乌鳢;W1组肠道有益菌OTU丰富度大于W2组,且W2组还存在一些潜在致病菌。本研究为乌鳢的健康养殖和后续肠道微生物资源的挖掘提供了理论依据。