复方中草药对小丑鱼非特异性免疫、消化酶活性的影响及对刺激隐核虫杀灭效果分析

刺激隐核虫寄生感染引起的“白点病”不仅危害水族箱观赏鱼类,还会对水族馆大水体海水观赏鱼带来毁灭性打击,是海水观赏鱼养殖业危害最为严重的病害之一。本研究探讨了在基础饲料中添加不同剂量复方中草药“XCY-1”(苦参、地肤子、蛇床子、黄芪、甘草等按一定比例混合,超微粉碎后收集备用)对小丑鱼血清、肝脏中非特异性免疫指标和肠道消化酶活性指标变化及不同用药方式对防治刺激隐核虫病的效果。研究结果显示,投喂复方中草药“XCY-1”可使小丑鱼血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)、酸性磷酸酶(ACP),肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)、总抗氧化能力(T-AOC)活性均呈现先升后降趋势,第21 d各项非特异性免疫指标达到最高值,其中20 g/kg剂量组效果最好,能显著提高小丑鱼的免疫能力;肠道中淀粉酶(AMS)、脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶在各取样点活性均高于对照组,20 g/kg剂量组在各取样点胰蛋白酶和AMS活性高于其他剂量组,20 g/kg和40 g/kg剂量组在各取样点LPS活性最高。复方中草药“XCY-1”药浴对刺激隐核虫幼虫的体外杀灭结果显示:4 h内,50 mg/L药物浓度即对刺激隐核虫幼虫具有一定的杀灭效果,400 mg/L药物浓度即可杀灭全部幼虫;当药物浓度达到800 mg/L时,3 h内幼虫全部死亡。不同用药方式防治小丑鱼刺激隐核虫病:实验分为4组,A组20 g/kg剂量组,口服无药浴;B组20 g/kg剂量组,口服且同时按50 mg/L进行药浴;C组20 g/kg剂量组,口服且同时按100 mg/L进行药浴;D组为对照组,仅投喂基础饲料。结果显示:实验第6 d,A、B、C三个药物组与对照组的存活率分别为:51.1%、53.3%、57.7%、0,药物组存活率显著高于对照组(P＜0.05);三个药物处理组每片鳃上仅有0~2个滋养体,对照组每片鳃上滋养体数量是用药组65倍。综上所述,饲料中添加复方中草药“XCY-1”可以提升小丑鱼血清、肝脏非特异性免疫指标和肠道消化酶活性,对刺激隐核虫病起到积极的预防和治疗效果。20 g/kg剂量组、投喂时间14~21 d时效果最佳。该研究为开发无公害、环保型天然植物源杀虫药提供理论参考和技术支撑。     

大黄鱼抗菌肽hepcidin-like的抗菌和抗寄生虫活性分析

近年来,我国重要经济鱼类大黄鱼（Larimichthys crocea）遭受了严重的海水白点病的感染,造成了巨大的经济损失。海水白点病是由体外寄生虫刺激隐核虫（Cryptocaryon irritans）感染引起,不仅能引起被感染鱼类生理的破坏,还能够引发二次细菌感染。有报道指出一些抗菌肽（antimicrobial peptides）具有抗刺激隐核虫的活性。大黄鱼hepcidin-like（命名为Lc-HepL）是从刺激隐核虫感染大黄鱼后的比较转录组中挖掘到的一个差异表达基因。本研究中,在基因和蛋白水平上分析了该抗菌肽的生物活性。刺激隐核虫感染后,qRT-PCR检测到Lc-HepL在鳃、肌肉、肝脏、头肾、肠道和脾脏6种组织中显著上调,并且上调的时间点出现在幼虫感染阶段、滋养体脱落阶段和二次细菌感染阶段,结果显示Lc-HepL在抗刺激隐核虫和二次细菌感染的免疫反应中发挥重要作用。在体外成功诱导并纯化的重组Lc-HepL（rLc-HepL）对某些病原菌具有剂量和时间依赖性的强抗菌活性。本研究首次探究了rLc-HepL的抗刺激隐核虫活性,显微观察结果显示其能引起幼虫细胞膜破裂、内容物外泄,该结果首次提供了大黄鱼hepcidin-like具有强抗刺激隐核虫活性证据。研究数据表Lc-HepL很可能是大黄鱼抗刺激隐核虫感染的一种重要的先天免疫因子,具有应用到未来的药物中的潜力。     

海水中硫丹及衍生物气相色谱快速测定及应用

通过固相微萃取(SPME)技术富集海水中6种硫丹及其衍生物,使用气相色谱-电子捕获检测器(GC-μECD)测定和外标法定量,建立海水中硫丹及其衍生物的快速测定方法。结果表明:硫丹及其衍生物的线性范围为2.5～100.0μg/L,相关系数为0.990～0.998,检出限为0.10～21.30 ng/L。在3个加标条件(5,10和25μg/L)下,人工海水硫丹的加标回收率为85.60%～119.50%,相对标准偏差(n=6)为1.3%～7.8%。实际海水硫丹的加标回收率为90.60%～120.70%,相对标准偏差为1.6%～7.9%。该方法应用于青岛近岸海域海水的测试,在青岛近岸水体中未检出α-硫丹和β-硫丹,检出硫丹衍生物:硫丹醚(N.D.～1.758μg/L),硫丹内酯(1.040～11.260μg/L)和硫丹硫酸酯(1.009～6.091μg/L)。实际应用表明该方法前处理简便易行、灵敏度高,并可满足海水中硫丹及其衍生物的快速检测分析。     

海水中硫丹及其衍生物气相色谱快速测定及应用

通过固相微萃取(SPME)技术富集海水中6种硫丹及其衍生物,使用气相色谱-电子捕获检测器(GC-μECD)测定和外标法定量,建立海水中硫丹及其衍生物的快速测定方法。结果表明:硫丹及其衍生物的线性范围为2.5～100.0μg/L,相关系数为0.990～0.998,检出限为0.10～21.30 ng/L。在3个加标条件(5,10和25μg/L)下,人工海水硫丹的加标回收率为85.60%～119.50%,相对标准偏差(n=6)为1.3%～7.8%。实际海水硫丹的加标回收率为90.60%～120.70%,相对标准偏差为1.6%～7.9%。该方法应用于青岛近岸海域海水的测试,在青岛近岸水体中未检出α-硫丹和β-硫丹,检出硫丹衍生物:硫丹醚(N.D.～1.758μg/L),硫丹内酯(1.040～11.260μg/L)和硫丹硫酸酯(1.009～6.091μg/L)。实际应用表明该方法前处理简便易行、灵敏度高,并可满足海水中硫丹及其衍生物的快速检测分析。     

致病性哈维氏弧菌:海洋寄生性纤毛虫的内共生细菌

哈维氏弧菌被观察到与海洋寄生性纤毛虫刺激隐核虫具有内共生现象,其作为一种致病性细菌,可导致感染刺激隐核虫的大黄鱼产生严重的继发性细菌感染。我们通过16s宏测序技术对刺激隐核虫的细菌群落进行鉴定,并通过标准的细菌培养方法分离鉴定出哈维氏弧菌。通过透射电镜和荧光原位杂交方法,在刺激隐核虫的细胞胞质中,均观察到内共生的哈维氏弧菌的存在;而在其细胞核中,则没有相关信号存在。哈维氏弧菌与刺激隐核虫的相关关系以及内共生的哈维氏弧菌对刺激隐核虫的影响作用,仍需要深入进行研究。     

南海西沙海域冬季海水重金属质量浓度水平及来源分析

为开展南海西沙海域海水重金属质量浓度水平测定及来源分析, 2021年12月采集了西沙海域6个站位的0～200m深度分层海水样品共24个。6个站位的温度、盐度、浊度、溶解氧、有色可溶性有机质和叶绿素的垂直剖面数据由盐温深测量系统现场测定。海水样品中的重金属质量浓度采用电感耦合等离子体–质谱仪进行测定,各站位Cu、Pb、Zn、Cd、Ni、Cr、As、Fe、Mn的质量浓度平均值范围分别为0.22～20.79μg·L^-1、未检出～0.25μg·L^-1、1.90～15.90μg·L^-1、0.13～0.17μg·L^-1、0.54～1.31μg·L^-1、0.29～0.33μg·L^-1、2.93～3.17μg·L^-1、0.39～1.23μg·L^-1、0.35～1.14μg·L^-1; Hg在各站位均未检出。仅有D2～D4站位的5m层海水中Cu或Zn浓度超过国家海水水质一类标准(GB 3097-1997),重金...     

紫红笛鲷白点病的防治试验

紫红笛鲷 (Ｌｕｔｊａｎｕｓａｒｇｅｎｔｉｍａｃｕｌａｔｕｓ)俗称红 ,为暖水性大型底层鱼类 ,是粤琼两省沿海网箱和渔养殖的名优种类。环境适应性强 ,海水、咸淡水都能养殖 ,甚至淡水中也能正常生长。在自然海区网箱养殖的紫红笛鲷很少发生暴发性的海水小瓜虫病 ,而在室内培养池里 ,当环境适宜时 ,海水小爪虫大量繁殖 ,疾病迅速蔓延 ,对紫红笛鲷产生极大危害。海水小瓜虫又称刺激隐核虫 (Ｃｒｙｐｔｏｃａｒｙｏｎｉｒｒｉｔａｎｓ) ,是一种纤毛虫类寄生虫 ,主要寄生于海水鱼的皮肤、鳍、鳃、眼角膜等处 ,对鱼的种类和个体大小没有明…     

大黄鱼cGAS-like基因isofrom X1的克隆鉴定及在感染刺激隐核虫后的表达变化

cGAS(cyclic GMP-AMP synthase)基因是近几年来新发现的先天免疫中一个新型的信号分子。作者基于大黄鱼(Larimichthys crocea)基因组信息,用cDNA末端快速扩增(RACE)技术在鳃组织中克隆鉴定了cGAS基因cDNA全长序列:包含1个231 bp的5′端-非翻译区(5′-UTR)、207 bp的3′-UTR和1 488 bp的开放阅读框(ORF),命名为Lc-cGAS-like X1。该基因编码1个由495个氨基酸残基组成的多肽,预测的分子量(Mw)大小为56.57kDa,理论等电点(pI)为9.45;序列分析表明其预测的蛋白无信号肽,第115～431位氨基酸序列为Mab-21功能域,第470～492位氨基酸序列为跨膜结构域。基因组全长3 153 bp,包含8个外显子和7个内含子,所有内含子的剪切特点都符合GT-AG规则。同源比对结果显示:Lc-cGAS-likeX1与鱼类cGAS的相似性大于66%,与高等脊椎动物的相似性较低。系统进化分析表明Lc-cGAS-like X1与鱼类cGAS聚成一支。荧光定量PCR(qPCR)检测显示Lc-cGAS基因(X1/X2两种剪切体)在大黄鱼9种组织中均有表达,其中在鳃中的表达量最高;刺激隐核虫感染后,大黄鱼免疫器官头肾中Lc-cGASmRNA分别在刺激隐核虫幼虫感染阶段和滋养体脱落阶段出现了极显著上调(P0.01);解毒器官肝脏中分别在滋养体脱落阶段和细菌感染阶段出现极显著上调变化(P0.01)。本研究结果暗示大黄鱼cGAS基因参与了大黄鱼感染刺激隐核虫的免疫防御过程,为进一步了解鱼类cGAS基因的多样化功能提供参考。     

胶州湾东北部海水中锌的存在形态及其分布

研究微量元素在海水中的存在形态是海洋化学上比较重要的课题之一,对了解微量元素在海洋中的循环具有重要的意义。关于锌在海洋中的存在形态曾有过详细的评论。 海水中的无机锌主要以Zn~+、Zn(OH)~+及Zn(CO_3)~0的形式存在。其含量范围一般在1—50μg/L之间,平均值约为3μg/L.近岸及河口区含量较高,个别测定值可高达300—400μg/L。关于海水中锌的测定方法如ASV法和分光光度     

乳铁蛋白对大黄鱼仔鱼生长、存活和抗应激能力影响的研究

用不同水平(分别为T1组:0 mg/L;T2组:50 mg/L;T3组:100 mg/L;T4组:150 mg/L)乳铁蛋白(lactoferrin,简称LF)强化的卤虫(Artemia franciscana)幼体投喂9~23日龄大黄鱼(Pseudosciaena crocea)仔鱼。结果表明,摄食LF强化卤虫幼体的大黄鱼仔鱼其生长无明显改善(P0.05),但大黄鱼仔鱼的成活率和抗应激能力显著提高,T3(60%)和T4(80%)组的成活率显著高于T1(40%)和T2(30%)组(P0.05)。T4组大黄鱼仔鱼的耐干露能力最强,T4组和T3组的抗高盐度(65)应激能力明显的强于T1和T2组(P0.05),T4组和T3组之间无明显的差异(P0.05)。经4 h高温(32°C)曝露后,T1和T2组的仔鱼全部死亡,T4组和T3组的成活率分别为30%和23.3%。即仔鱼的成活率和抗应激能力受卤虫强化LF水平的影响显著,LF强化的有效剂量为不低于100 mg/L强化水体。     

刺激隐核虫ADP/ATP 载体蛋白基因的克隆和分子特征分析

刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)是严重危害海水鱼类的寄生纤毛虫,为了对其进行分子水平的研究,采用SMART技术构建了刺激隐核虫滋养体期的cDNA文库,并随机挑取克隆做EST测序,获得大量克隆的基因。从中挑选ATP/ADP载体蛋白基因同源物(CiAAC)的克隆进一步测序获得全长的cDNA序列。该序列全长为1029bp,包含编码287个氨基酸的开放阅读框。用RT-PCR分析了其在刺激隐核虫各时期的表达情况,并应用生物信息学分析方法,对CiAAC基因进行不同物种的系统进化树分析、功能区分析、物理性质分析、疏水性分析、跨膜结构域预测、亚细胞定位、二级结构预测等等。结果表明:CiAAC蛋白在刺激隐核虫各时期均有表达;据预测,它为六次跨膜蛋白,与卵形肠虫(Nyctotherus ovalis)的ADP/ATP载体蛋白的同源性最高,相似性达65%;蛋白为疏水性,并定位于刺激隐核虫的细胞质中。随后实验中通过对基因的定点诱变,将纤毛虫的非通用密码进行改造后,构建了pGEX-4T-1/CiAAC表达载体。以上实验为病原生物刺激隐核虫CiAAC载体蛋白的研究及应用提供了基础资料。     

基于FIA和光学原理的酶传感器检测海水甲基对硫磷

将乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase,AChE)传感器与流动注射系统(flow injection analysis system,FIA)相结合,通过光学方法测定固定化酶受农药抑制后的残余活性,对海水中微量甲基对硫磷进行定量分析。该系统的适宜工作条件为:温度30℃;固定化酶的用量0.05 U;载液流速0.45 mL/min;进样时间20 min;底物(碘化硫代乙酰胆碱)溶液浓度0.100 mol/L,注射量100μL。在0.1~100μg/L之间,农药浓度的对数值与固定化酶活性的抑制率之间具有良好的线性关系(r=0.995 3)。利用该系统检测含甲基对硫磷分别为0.8μg/L和5.0μg/L的模拟海水样品,获得了较好的准确度和精密度,平均相对误差和变异系数均小于10%。     

海水中锌、镉、铅、铜的微分电位溶出分析

提出一种简便快速、直接测定海水中锌、镉、铅、铜的微分电位溶出分析方法,海水适宜酸度为(3.0—4.5)×10~(-3)mol/LHNO_3,适宜盐度1.6—31。电解(富集)时间600s时,检出限为0.02μg/L Zn~(2+),0.02μg/L Cu~(2+),0.01μg/L Cd~(2+),0.006μg/L Pb~(2+)。在青岛近岸海水中加1.0μg/L Zn~(2+),Pb~(2+),Cu~(2+)和0.5μg/L Cd~(2+),测定的相对标准偏差分别为2.9％,3.1％,5.8％和5.1％。应用于近岸海水及中国标准海水中锌、镉、铅、铜的测定,结果满意。     

海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)趋化性研究

应用本实验室建立的趋化模型对海水鱼类寄生虫刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)的趋化特性进行研究。结果显示, 刺激隐核虫幼虫在30min时趋化达到饱和, 在温度28℃时趋化率达到最高; 多种硬骨鱼的血清与粘液对刺激隐核虫的幼虫都有着强烈的吸引作用, 刺激隐核虫幼虫对碳水化合物、氨基酸等小分子物质没有趋化作用; 在组织匀浆液中, 刺激隐核虫幼虫对肌肉匀浆液有一定的趋化作用, 对肝、肠、胃的匀浆液都没有趋化作用; 感染后鱼类血清对刺激隐核虫的幼虫有着更加强烈的吸引作用(P<0.01); 18种中草药中的五倍子、大黄、槟榔、苦楝、虎杖、贯众等6种中药草对刺激隐核虫的幼虫有一定的驱虫作用。本文的研究结果有助于深化对刺激隐核虫致病性的认识并对“白点病”的防治有一定的参考价值。     

惠州海水重金属污染特征及生态风险评估

重金属是主要的环境污染物之一。文章对惠州近岸海域19个站位的表层海水重金属含量进行分析,利用算术均值型多因子指数法和Hakanson指数法进行重金属污染和生态风险评价。结果显示:(1)2015年8月,惠州海水Cu、Zn、Cr、Cd、Hg、As等6种重金属元素平均值分别为4.85μg/L、4.85μg/L、0.595μg/L、0.263μg/L、0.045μg/L、2.85μg/L,符合海水水质第一类标准,Pb含量平均值为8.46μg/L,符合第三类海水水质标准。(2)算术均值型多因子指数(I=0.379)说明,惠州海水重金属污染级别为尚清洁。(3)相关分析显示,海水中Zn、Hg具有同样的来源,pH对海水Pb分布有重要影响。(4)潜在生态危害系数Eir值由大到小依次为Hg、Pb、Cu、Cd、As、Zn、Cr,综合潜在生态危害指数(RI=22.6)表明惠州海水重金属具有轻微生态危害。     

黄芪多糖对大黄鱼头肾巨噬细胞的免疫调节作用

为探究黄芪多糖(Astragalus polysaccharide,APS)对大黄鱼(Larimichthys crocea)头肾巨噬细胞的免疫调节作用,本研究从植物黄芪中分离纯化得到APS,用流式细胞仪检测其对头肾巨噬细胞呼吸爆发和吞噬活性的影响,并采用qPCR检测APS对3种细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6基因转录水平的影响。实验结果显示,50、100、200、400、800μg/cm 3 APS可以显著抑制巨噬细胞的氧呼吸爆发(ROS);100、200、400、800μg/cm 3 APS可以显著抑制细胞的氮呼吸爆发(NO);50、100、200μg/cm 3 APS预处理后可以显著增强脂多糖(LPS)刺激头肾巨噬细胞的吞噬活性;200μg/cm 3 APS可以显著增强TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA在6、12、24 h的表达量。结果表明,APS对离体培养大黄鱼头肾巨噬细胞有明显的免疫调节作用。     

刺激隐核虫甘油醛-3-磷酸脱氢酶的分子特征

从刺激隐核虫(Cryptocaryon irritans)滋养体/包囊前体c DNA文库中筛选出了甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(Ci GAPDH),定点诱变Ci GAPDH基因开放阅读框内的非通用密码子后,构建其原核表达载体p GEX-4T-3/Ci GAPDH,转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,用异丙基硫式-B-D-半乳糖苷诱导表达,结果大肠杆菌成功表达了r Ci GAPDH蛋白。用抗r Ci GAPDH蛋白的鼠血清进行免疫印迹分析,结果抗血清能够识别刺激隐核虫各期虫体的天然Ci GAPDH蛋白,其表观分子质量为37.3 ku,与根据氨基酸序列推算的理论值相符;实验表明r Ci GAPDH蛋白具有很好的免疫原性,而且Ci GAPDH在生活史的各阶段均有表达,符合持家基因的特征。利用间接免疫荧光抗体实验(IFAT)检测天然Ci GAPDH蛋白在刺激隐核虫幼虫上的定位,结果表明天然Ci GAPDH蛋白主要分布在幼虫的细胞质内,且在胞口位置分布最多。对Ci GAPDH的进一步研究可能为刺激隐核虫感染的药物靶点的寻找多条线索。     

吡啶硫酮类防污剂对华美盘管虫早期不同发育阶段的毒性效应研究

以中国南海常见的多毛类——华美盘管虫(Hydroides elegans)作为受试生物,分别研究了吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌对早期不同发育阶段的华美盘管虫的急性毒理效应。发现暴露于吡啶硫酮铜的华美盘管虫精子和卵子的受精半数抑制浓度(IC50)分别为19.49μg/L和88.44μg/L,担轮幼虫24 h半数致死浓度(24h-LC50)和48 h半数致死浓度(48h-LC50)分别为7.35μg/L和5.00μg/L,后担轮幼虫24h-LC50和48h-LC50分别为8.57μg/L和5.87μg/L;暴露于吡啶硫酮锌的华美盘管虫精子和卵子的受精IC50分别为36.74μg/L和159.59μg/L,担轮幼虫24 h-LC50和48 h-LC50分别为8.57μg/L和6.67μg/L,后担轮幼虫24 h-LC50和48 h-LC50分别为12.03μg/L和8.07μg/L。表明华美盘管虫早期发育的不同阶段对吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌的敏感性表现出一定差异,与配子受精率和后担轮幼虫的毒性反应相比,担轮幼虫对吡啶硫酮铜和吡啶硫酮锌的毒性表现出较高的敏感性;而且,对吡啶硫酮铜的敏感性普遍高于吡啶硫酮锌。     

液相色谱—原子荧光联用测定海水中无机砷和有机砷

本文研究并建立了海水中测定砷形态的液相色谱—原子荧光法,进行了实验参数流动相浓度、pH、流速的优化。在优化的实验条件下,采用Hamilton PRP-X100分析柱在6 min内可以完成三价砷、甲基砷和五价砷3种形态的分离、检测。在载流5%HCl,还原剂2%KBH4和0.5%KOH,进样量100μL条件下,三价砷、甲基砷和五价砷检出限分别为0.31μg/L、0.52μg/L和0.36μg/L。在浓度2～80μg/L范围内,3种砷形态均有良好的线性关系,相关系数均优于0.999。用本文所建立的方法进行了海水样品中无机砷和有机砷形态的测试,海水中三价砷、甲基砷的含量较低,五价砷稍高,说明海水中砷形态主要以五价砷存在,当加标量为5～10μg/L时,加标回收率在73%～104%之间。该方法操作前处理简单,灵敏度高、运行费用低廉,适用于海水中砷形态的测试。     

壳聚糖硫酸酯金属配合物的抗氧化活性

以吩嗪硫酸甲酯-NADH为超氧阴离子自由基(O_2~(·-))产生、检测体系和EDTANa_2-Fe(Ⅱ)-H_2O_2为羟自由基(~·OH)产生、检测体系,对壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物和不同分子质量壳聚糖进行了抗O_2~(·-)和~·OH自由基的活性研究.结果表明,壳聚糖硫酸酯金属配合物对于O_2~(·-)自由基的清除能力明显高于壳聚糖,在质量浓度为0.025 g/L时,壳聚糖硫酸酯铜配合物对O_2~(·-)自由基的清除能力达到94.18%,壳聚糖硫酸酯锌配合物达到93.19%;壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物对~·OH自由基的清除能力(67.39%、60.46%)低于相同分子质量的壳聚糖(88.06%),而高于高分子质量壳聚糖761 ku(18.71%);壳聚糖分子质量大小对O_2~(·-)和~·OH自由基的清除能力有较大影响,质量浓度为1.6 g/L壳聚糖分子质量为20 ku时,对O_2~(·-)清除率达54.69%,而分子质量在761 ku时,对O_2~(·-)清除率仅为35.50%;各样品对O_2~(·-)和~·OH自由基的清除能力均随着质量浓度的增加而上升,壳聚糖硫酸酯铜、锌配合物在相当低的浓度下(0.025 g/L)就可以达到明显清除O_2~(·-)自由基的效果(≥90%).