寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)感染山东半岛养殖梭子蟹的初步研究

寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)逐渐成为危害我国沿海养殖三疣梭子蟹、锯缘青蟹、脊尾白对虾等蟹虾类的致病性病原。为研究血卵涡鞭虫在我国北方的感染、流行情况,2012年7—11月间,作者从山东半岛三疣梭子蟹的主要养殖区域和邻近海域随机采集梭子蟹样品,进行了血淋巴、组织病理、电镜和分子生物学检测,首次在从胶南和莱州湾养殖区采集的梭子蟹中发现了血卵涡鞭虫感染。在感染血卵涡鞭虫的梭子蟹血淋巴中,共发现了该寄生性病原的四个生活史阶段:丝状滋养体、单细胞滋养体、滋养体聚合体和多核孢子体;该区域发现的血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)形态上与其他报道Hematodinium spp.类似,与在我国东南沿海报道发现的血卵涡鞭虫有亲密的遗传关系;人工感染实验表明该寄生性虫具感染性并对宿主的主要器官造成显著的病理变化。该研究表明血卵涡鞭虫感染养殖蟹类不仅局限于我国东南沿海,在我国北方的养殖蟹类中也存在;这些养殖区普遍采用的混合养殖模式可能一定程度上加剧了该寄生性病原的传播、扩散,因此其传播扩散方式亟需进一步调查研究。     

海水甲壳类寄生性甲藻Hematodinium spp.研究进展

寄生性甲藻Hematodinium是一类危害海水甲壳类的致病性寄生性甲藻,在世界范围内严重威胁了多种重要经济甲壳类的渔业生产。近年来,Hematodinium先后在我国浙江、广东沿海的锯缘青蟹、三疣梭子蟹、脊尾白对虾等重要养殖甲壳类中报道发现, 并已确定该寄生甲藻是近年来引起当地养殖青蟹“黄水病”、三疣梭子蟹“牛奶病”和脊尾白对虾大规模死亡的主要病原之一。本文结合作者近年来Hematodinium的研究成果,系统综述了国内外该寄生性甲藻的研究进展,包括其系统分类、生活史、传播途径、发生机制等;并针对目前该寄生性甲藻研究中存在的关键问题,结合我国相关研究的现状做出了分析和展望,以期为我国海水甲壳类寄生性甲藻发生的预防与控制提供理论依据和技术支持。     

池塘养殖脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)感染血卵涡鞭虫的研究

通过现场取样、显微镜检、细菌培养、组织病理、电镜观察以及PCR检测等研究手段,对2008年9月浙江省舟山市普陀区某梭子蟹养殖塘混养的脊尾白虾"白浊病"进行了系统的病原学研究。结果表明,病虾体色发白,反应迟钝,血淋巴液呈浊白色,严重患病白虾血淋巴中的血细胞几乎没有或者极少,代之以大量与血细胞形似的寄生虫;组织病理切片及电镜观察发现,病虾心脏、肝胰腺、肌肉、鳃部等组织寄生有大量单细胞寄生虫,该寄生虫虫体形态特征、显微结构及宿主临床症状与本实验室之前研究报道的感染三疣梭子蟹和锯缘青蟹的血卵涡鞭虫类似;采用已建立的针对血卵涡鞭虫ITS1基因的引物对"白浊病"病虾的血淋巴样品进行PCR检测,可扩增出585bp左右的特异条带。综合以上研究结果,确定该寄生虫为血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)。有关脊尾白虾感染该寄生虫的报道在国内外尚属首次。     

血卵涡鞭虫在养殖锯缘青蟹中的寄生

利用光镜和电镜对2005年9月浙江三门湾地区某养殖场发生的养殖锯缘青蟹规模性死亡病蟹进行观察，并对病原进行分子生物学鉴定。组织病理学研究发现，病蟹蟹体消瘦，肌肉白浊，头胸甲内可见大量乳白色液体，血淋巴细胞的量急剧减少，代之以大量寄生原虫，该原虫在病蟹的肝胰腺、鳃、心脏、肌肉等部位大量寄生，引起这些组织发生以坏死为主的变质性病变。电镜下，乳白色液体及病变组织内可见大量寄生虫体，其形态特征、内部结构及宿主表现的症状，与血卵涡鞭虫相类似。采用Small等^[5]的血卵涡鞭虫ITS特异引物，扩增出分子量为300bp左右的条带，并对其进行了测序及序列相似性比较，确定该寄生原虫为一种血卵涡鞭虫Hemntodinium sp。血卵涡鞭虫是海水甲壳类的重要病原寄生虫，我国尚未有该寄生虫病的研究报道，文中首次发现其在养殖锯缘青蟹中的寄生，为靳一步研究该寄生虫病积累了资料。     

日照沿海养殖三疣梭子蟹血卵涡鞭虫流行病发生过程研究

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类严重危害海洋甲壳类动物的新型寄生性病原,可引发养殖三疣梭子蟹“牛奶病”,导致梭子蟹大量死亡,造成巨大经济损失。目前,对于血卵涡鞭虫在日照养殖梭子蟹中的流行发生情况还未见报道,2020年8月和2021年5～11月期间在日照主要梭子蟹养殖区开展流行病学调查研究,通过形态学观察、组织病理检测和分子生物学鉴定发现了血卵涡鞭虫(Hematodinium perezi)在日照地区的流行分布,并发现其流行病发生在6～9月间,高发期为7～8月,感染率高达52.5%。感染宿主的血淋巴和心脏、肝胰腺、鳃、肌肉等组织中发现了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子前细胞和孢子等血卵涡鞭虫的多个生活史阶段。在养殖池塘环境水体中检测到血卵涡鞭虫存在,水体中血卵涡鞭虫丰度与宿主感染率存在错峰现象,间隔3～4周。流行病的发生与水体温度和盐度变化密切相关,7～8月较高的水温(26.2～28.6°C)促进了血卵涡鞭虫在宿主体内快速增殖及流行病爆发,而较低的盐度(20.7～25.3)可能抑制了环境水体中血卵涡鞭虫的存活及其传播扩散。以上研究结果初步...     

中国沿海寄生性病原血卵涡鞭虫(Hematodinium sp.)的遗传多样性研究

血卵涡鞭虫是一类感染海洋甲壳类动物的寄生性甲藻。本研究通过对我国山东、浙江和广东三地的血卵涡鞭虫群体进行r DNA基因(包括5.8S,ITS1和ITS2)的测序和遗传分析,研究了我国沿海养殖蟹类中血卵涡鞭虫群体的遗传多样性以及与美国和欧洲群体的亲缘关系。结果表明,流行于我国沿海地区养殖蟹类中的血卵涡鞭虫群体存在一定的遗传多态性,共发现14个单倍型,其中单倍型ST041a在各个群体中均有出现,且发生频率较高;而三个地理群体之间无明显遗传差异,侵染不同宿主(三疣梭子蟹和拟穴青蟹)的株系间也无显著遗传差异。另外,我国的上述群体在遗传上是不同于国际上其他地区的独立分支,属于Hematodinium perezi基因型Ⅱ;其亲缘关系与美国兰蟹中的株系较近(遗传距离D=0.027),而与欧洲冷水株系稍远(D=0.236)。本研究肯定了血卵涡鞕虫是一类"泛宿主"型病原生物,即在同一地区可侵染不同的甲壳类宿主。我国沿海地区的蟹类养殖应避免不同种类间的混养,以及不同地区间的引种交换,以防止血卵涡鞕虫流行病的进一步扩散。     

血卵涡鞭虫感染三疣梭子蟹的病原形态学及组织病理学变化

血卵涡鞭虫是一类主要感染海产甲壳类的致病性寄生性甲藻。近年来,该寄生性病原在我国沿海主要经济蟹类养殖区域流行性发病,给当地蟹类养殖业造成了严重经济损失。为厘清血卵涡鞭虫的生活史形态,了解宿主的病理损伤机制,本文通过血涂片法和HE染色法系统研究了感染过程中该寄生虫的形态变化和宿主的组织病理变化。结果表明,血卵涡鞭虫在感染过程中经历丝状滋养体、单核/双核/多核滋养体、团聚体、蛛网状滋养体、孢子前细胞及孢子等不同生活史阶段。感染导致三疣梭子蟹发生系统性病理变化,肝胰腺、心脏、鳃、肌肉等器官和组织在不同感染阶段均发生相应程度的组织病理变化,主要表现为体细胞破损或坏死、细胞间隙模糊、疏松结缔组织充斥大量寄生虫细胞。最终由于寄生虫在宿主主要器官组织间隙内大量增殖,导致重度感染的梭子蟹器官或组织功能破坏、丧失而死亡。     

拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学分析

为解析拟穴青蟹(Scylla paramamosain)血卵涡鞭虫病的流行病学特征,于2012年4—11月采用跟踪监测和实地调查的方法,结合病原分离鉴定及病蟹的病理学观察,统计分析了浙江省温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的流行情况。结果表明,患病拟穴青蟹的肝胰腺、肌肉、鳃等组织病理显示有大量血卵涡鞭虫侵染,并能用PCR方法快速检出。温州地区养殖拟穴青蟹血卵涡鞭虫病在每年5—11月均有发生,7—9月为集中发病时间,死亡高峰出现于8—9月之间,年份间(2010—2012)与发病率无相关性,而不同月份对病害的发生有极显著影响(P0.01)。不同发育阶段以脱壳期的发病率相对较高,发病蟹的规格主要以50g以下的幼蟹和250g以上的成蟹为主。拟穴青蟹血卵涡鞭虫病的发生与水温(r=0.756)和盐度(r=0.631)变化关系较密切,夏、秋季节受梅雨、台风影响而引起水温和盐度的剧烈变化可能是暴发血卵涡鞭虫病的诱发因素。     

海洋寄生甲藻血卵涡鞭虫生活史及温度对其发展的影响

血卵涡鞭虫(Hematodinium spp.)是一类感染海水甲壳类的致病性寄生甲藻,在全球主要经济蟹、虾类中频繁导致流行性病害,严重危害我国沿海重要经济蟹类的渔业生产。为进一步厘清血卵涡鞭虫的生活史,通过血涂片法、H&E染色法(hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色法)和体外培养方法系统研究了从我国沿海天津厚蟹(Helice tientsinensis)中分离的血卵涡鞭虫株系的生活史,描述并比较了血卵涡鞭虫在宿主体内(血淋巴、组织)和体外培养体系中各生活史阶段的细胞形态,并进一步探究了温度对血卵涡鞭虫生活史发展的影响。结果表明,血卵涡鞭虫在感染宿主过程中经历了丝状滋养体、类变形虫滋养体、蛛网状滋养体、团块状聚合体、孢子母细胞、孢子前细胞和孢子等生活史阶段。温度显著影响血卵涡鞭虫的细胞生长发育与增殖过程;在实验低温(10℃)和高温(30℃)条件下,血卵涡鞭虫不能在宿主体内顺利寄生增殖;在15~25℃范围内,温度越高其细胞生长发育及细胞增殖速度越快,而在15℃和20℃条件下,血卵涡鞭虫可在感染的天津厚蟹体内产生大量游动孢子并释放到水体中。     

三疣梭子蟹含硒谷胱甘肽过氧化物酶基因克隆及其表达分析

为探究三疣梭子蟹的免疫机制以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)在甲壳动物响应寄生虫感染免疫过程中的作用,本研究采用RACE方法从三疣梭子蟹中克隆获得硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶基因的全长cDNA序列,其cDNA序列全长为696bp,5′-UTR长度为102bp,3′-UTR长度为87bp,开放阅读框长度为507bp,编码168个氨基酸,其中含有一个典型的由蛋白石终止密码子(220TGA222)编码的硒半胱氨酸(40U)。预测了该基因编码的氨基酸序列及其中的保守结构域,包括GPx家族签名序列(64LAFPCNQF71)、活性位点序列(152WNFEKF157)以及与酶催化活性相关的氨基酸位点包括谷氨酰胺(74Q)、精氨酸(90R和168R)和色氨酸(142W)。相似性比对和系统发育分析结果表明,三疣梭子蟹硒半胱氨酸-谷胱甘肽过氧化物酶(SeGPx)与甲壳动物中的SeGPxs相似性较高,其中与拟穴青蟹SeGPx相似性最高,并与其在系统发育树中聚为一支。经血卵涡鞭虫侵染后(0—192h),SeGPx基因在三疣梭子蟹的血细胞、肝胰腺和鳃组织中的转录水平均发生显著性升高。该结果表明,SeGPx在三疣梭子蟹应对血卵涡鞭虫的免疫反应中发挥重要作用,可通过调控甲壳宿主体内被病原扰乱的氧化还原状态进而起到宿主组织保护作用。     

中国海水蟹主要流行性疾病及其病原分析

<正>近年来,随着海水蟹类育苗技术与养殖规模的不断发展,海水蟹的疾病也因其广泛流行性和集中暴发性而日益受到业界关注。"黄水病"、"红水病"、"乳化病"和"肝胰腺白化病"等是中国海水养殖品种——拟穴青蟹(Scylla paramamosain)、锯缘青蟹(Scylla serrata)和三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的常见流行性疾病,不仅每年对中国海水蟹养殖业造成重大年经济损失,而且严重威胁中国海水蟹养殖业的健康发展和生态安全。海水蟹类流行     

脊尾白虾和三疣梭子蟹健康养殖技术探讨

虾、蟹混养的传统方法越来越难以保证养殖成品的质量安全.文章介绍了脊尾白虾和三疣梭子蟹健康养殖的技术要领与实践成果.     

三疣梭子蟹与凡纳滨对虾混养实验研究

采用海水陆基围隔实验方法探讨三疣梭子蟹和凡纳滨对虾混养的适宜配比和水环境的变化,并比较其养殖效果.实验中对虾6个放养密度分别为0,15,45,75,105,135 尾/m~2;三疣梭子蟹的密度为6尾/m~2.实验结果表明,经过60 d的养殖,混养组梭子蟹的成活率、规格和净产量均优于梭子蟹单养组,其中,混养对虾密度为45尾/m~2组(45.71%,43.22 g/ind,1 191 kg/hm~2)最高,其次是75尾/m~2组(44.58%,39.13 g/ind,1 050 kg/hm~2),梭子蟹单养组(35.13%,32.87 g/ind,693 kg/hm~2)最低.混养6尾/m~2密度梭子蟹条件下,对虾的养成规格和成活率与对虾密度呈负相关.实验后期各混养组水体中总氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐和总氮含量均显著高于单养组,且随对虾放养密度增高显著上升.水体总氨氮含量各混养组在养殖50 d后均超过500 μg/L.本实验表明:三疣梭子蟹与凡纳滨对虾混养的最佳配比为三疣梭子蟹6尾/m~2,对虾45～75尾/m~2.     

中华绒螯蟹“牛奶病”病原及其致病性研究

针对2020年4月—5月天津地区暂养的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)扣蟹大规模暴发的"牛奶病",开展了病原分离、鉴定和致病性研究。从发病扣蟹体内分离到1株优势菌JMB-1,注射感染试验证实该菌株对中华绒螯蟹具有较强致病性,死亡率100%,病症与自然发病蟹相同;采用浸浴方式也可感染健康中华绒螯蟹,感染率相对较低,从濒死蟹体内可分离到形态与JMB-1一致的菌株。采用细菌分离、显微镜观察、PCR等技术排除细菌、中华绒螯蟹螺原体、血卵涡鞭虫、对虾白斑综合征病毒等病原的原发感染,确定菌株JMB-1为本次"牛奶病"的唯一确定病原。通过形态观察、生理生化试验及18S rRNA、26S rRNA、ITS基因序列分析将菌株JMB-1鉴定为二尖梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。扫描电镜结果显示,病蟹肝胰腺、肌间隙及结缔组织中存在大量出芽生殖的病原菌。2020年5月—10月,对天津地区稻田中养殖的中华绒螯蟹扣蟹及成蟹进行检测,未发现二尖梅奇酵母,推测"牛奶病"的暴发与养殖环境密切相关。     

贝类病害学研究进展：Ⅱ.贝类寄生虫病学研究

概述了海水养殖贝类体内发现的各种寄生虫，重点论述了单孢子虫病和柏琴类原虫病的病原生物学、流行病学规律、组织病理及致病机制等方面的研究进展，提出了我国在贝类寄生早学研究中亟需进行的工作。     

溶藻弧菌对三疣梭子蟹抗氧化酶系统的影响

从患乳化病的养殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体组织内分离出痛原菌--溶藻弧菌(Vibrioalginglyticus),通过肌肉注射的方式对三疣梭子蟹进行感染实验,对照组注射等量的生理盐水,在感染后O、24、48和72 h分别采集不同处理组三疣梭子蟹的血淋巴、肌肉和肝胰腺组织,测定溶藻弧菌对其各组织抗氧化相关酶活的影响.结果表明:注射生理盐水的对照组三疣梭子蟹体组织中抗氧化酶和MDA含量在不同的采样时间变化不显著(P>0.05).与对照组比较,三疣梭子蟹感染溶藻弧菌后血淋巴、肌肉和肝胰腺组织中SOD活性随着感染时间的延长显著降低(P<0.05).在感染溶藻弧菌24 h时血淋巴和肝胰腺组织中GSH-px活性有增强的趋势(P>0.05),随后在感染48 h后GSH-px活性显著降低(P<0.05);感染组各体组织中的MDA含量均随着感染时间的延长而显著上升(P<0.05).结果显示梭子蟹感染溶藻弧菌后机体消除氧化过程自由基的抗氧化酶活降低,脂质过氧化物水平升高,使得抗氧化防御能力下降.     

三疣梭子蟹和华溪蟹主要器官比较组织学的初步研究

近年来随着养殖业的发展,蟹类病害频繁发生,日趋严重。在开展病害研究过程中,由于三疣梭子蟹Portunus trituberculatus的SPF(无特定病原体)材料难于获得,而试验蟹的获得又受到养殖条件、养殖周期等因素的限制,因此阻碍了相关研究的开展,尤其是病毒学研究的进展。筛选一种可替代的模式生物,并开展相关研究显得尤为迫切。华溪蟹Sinopotamon和三疣梭子蟹亲缘关系较近,作为野生的蟹类容易获得,价格低廉,也容易在实验室条件下饲养。笔者在梭子蟹病原研究中发现,华溪蟹不带梭子蟹病原,但在实验条件下可感染相关病原,是开展此两类蟹病原体研究的较好实验动物,有必要开展这两种蟹的组织比较形态学的基础研究,以支持相关的应用研究。笔者经过对三疣梭子蟹和华溪蟹的组织石蜡切片观察发现,两种蟹的各组织器官结构基本相似,各组织结构都由4层构成,即粘膜层、粘膜下层、肌层和外膜。上皮细胞分泌物形成几丁质板,覆盖在上皮细胞表面。三疣梭子蟹的食管粘膜下层较发达。华溪蟹食管粘膜下层的肌层均相对较薄,食管腔较小。这两种蟹的胃壁结构无明显差别。在三疣梭子蟹的局部胃壁,可见嗜酸性几丁质层,上皮细胞顶部间有间隙,间隙中有一些嗜碱性物质。三疣梭子蟹肠粘膜下层不明显。华溪蟹的中肠非常细小,被肝胰腺等组织包裹,难以分离,管腔小,管壁外结缔组织少。两种蟹肝胰腺均由许多分枝的肝小管组成,小管间为结缔组织,血窦。肝小管由单层柱状上皮构成,高低不等,可以明显区分出分泌细胞、吸收细胞、储存细胞和胚性细胞4种形态的细胞,其功能也不同。三疣梭子蟹鳃轴基本弯曲,窄处鳃轴与鳃丝粗细相当,鳃丝和鳃小片间隔较大。华溪蟹鳃轴笔直延伸,窄处鳃轴明显粗于鳃丝,鳃丝间隔较小。两者鳃小片均由扁平上皮组成,外侧有薄层几丁质板。华溪蟹的鳃血管中可以明显看到较多染成红色的血细胞。三疣梭子蟹心肌纤维排列松散,线粒体较少,形态多样。华溪蟹心肌纤维排列致密,线粒体多呈群分布,且数量更多。心肌由梭形心肌细胞组成,有横纹,彼此相连成网,其周围有少量原生质。肌细胞的核呈棒状。     

日本蟳线粒体16SrRNA和COI基因序列比较分析

对采自莱州湾和胶州湾的日本蟳野生群体的线粒体16S rRNA和COI基因片段进行了PCR扩增和测序,分别得到长度为519和658 bp的碱基序列.研究结果显示这2个基因片段在种内的变异都较低,对2个基因同源序列分析表明,在线粒体16SrRNA基因片段中共检测到7个变异位点(包括6个单一变异位点,1个简约信息位点)和7种单倍型;在COI基因中共检测到8个变异位点(包括6个单一变异位点,2个简约信息位点)和7种单倍型.通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数,分析比较了两群体间的序列差异和遗传多样性水平.结果显示2个日本蟳野生群体的遗传多样性比较丰富.用MEGA4.0软件构建了NJ和UPMGA系统树,基于16SrRNA基因片段的系统树显示梭子蟹科的4个属聚为两大支:日本蝇不同的单倍型先聚在一起,然后与青蟹属的3种蟹聚为一支;梭子蟹属的三疣梭子蟹、远海梭子蟹及塞氏梭子蟹聚在一起;再与美青蟹属的美洲蓝蟹、巴西蓝蟹等聚为一支.基于COI基因显示日本蟳不同的单倍型先聚在一起,再与其他3种蟳聚为一支;梭子蟹属的远海梭子蟹和三疣梭子蟹相聚,然后与美青蟹属的2种蟹相聚为一支.该结果与传统分类一致.这些数据为我国日本蟳的种质资源保护和利用提供了基础的分子生物学依据.     

鲈鱼的鳃寄生车轮虫病及扫描电镜观察

报道鲈鱼的鳃寄生车轮虫病及病理组织的扫描电镜观察。病原鉴定为 :直钩车轮虫、杜氏车轮虫、日本车轮虫、劳牧小车轮虫及简单两分虫 5种车轮虫科纤毛虫 ,其中数量上占优势的为直钩车轮虫。扫描电镜观察结果表明 ,鳃寄生车轮虫可对宿主的上皮组织产生明显的机械性损伤并造成鳃丝粘液分泌增多及炎症反应。文中就海水养殖鱼类及野生鱼类由车轮虫寄生造成的危害及防治途径做了探讨。     

白斑综合征病毒对脊尾白虾的致病性研究

2010年、2011年江苏沿海多数地方海水养殖中发生了脊尾白虾大规模死亡的现象,本课题通过对患暴发性流行病的脊尾白虾(Exopalaemon carinicauda)进行病毒分子生物学检测,发现病虾体内白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,简称WSSV)检测普遍呈阳性;应用发病虾组织制备的病毒粗提液,进行了人工感染实验,实验表明该病毒对脊尾白虾具有较强的致病性,可引起68.5%的死亡率。电镜结果表明,发病虾与感染病虾鳃及肝胰脏等组织器官都发生了相同的细胞病理变化,主要表现为细胞核内染色质边聚、线粒体肿胀、内嵴消失等一系列细胞病理变化,在其细胞核与细胞质中发现了具有单层囊膜结构的对虾白斑综合征病毒粒子,病毒粒子大小约为(130~170)nm×(305~405)nm,核衣壳呈子弹形,一端较细另一端较粗,完整病毒粒子由核心、衣壳和囊膜构成,分子生物学实验表明该病毒为WSSV。实验结果符合柯赫氏法则,可以初步推断WSSV感染脊尾白虾并与引发的大规模死亡有着直接关系。