弧菌DS32褐藻胶裂解酶基因vralg1的异源表达和酶学性质研究

对从福建省东山湾沉积物样品中筛选到的菌株Vibrio sp. DS32的褐藻胶裂解酶基因vralg1进行克隆和异源表达,并对其酶学性质进行评估。以DS32基因组为模板,克隆褐藻胶裂解酶基因vralg1,构建了pET-vralg1重组表达载体,并在大肠杆菌中实现了异源表达,对重组酶VRALG1的酶学性质、底物特异性和完全降解产物等进行了测定。结果表明：重组酶VRALG1最适温度为35℃,在5～50℃范围内相对酶活力达到80%以上,最适pH为6.5～7.5,在pH为6.0～9.0范围内保温1 h后相对酶活力在90%以上;重组酶VRALG1最大反应速率为5.919 mmol/(L·min),米氏常数为3.712 mmol/L,最适条件下比活力为5.874 U/mg; K⁺、Cs⁺、Na⁺、咪唑和乙醇对酶活性影响较小,5 mmol/L或50 mg/mL浓度下相对酶活力保持90%以上,EDTA对酶的抑制作用明显,1 mmol/L浓度下可使酶完全失活;重组酶VRALG1对海藻酸钠和聚古罗糖醛酸具有较高的降解活性,TLC分析显示产物主...     

深海高温淀粉普鲁兰酶异源表达及酶活分析

深海热液口厌氧古菌Thermococcus siculi HJ21中的高温淀粉普鲁兰酶进行分子进化树系分析,并在大肠杆菌中通过pMal-c2x载体表达并纯化其N端催化结构域.通过融合表达,在N端催化结构域的N端融合有麦芽糖结合蛋白MalE.对该融合蛋白的α-淀粉酶和普鲁兰酶活性进行了实验分析.融合蛋白的两种酶活的最适温...     

Flammeovirga sp. SJP92琼脂酶的分离纯化及其酶学性质

琼胶酶是一类能够降解琼脂糖生成琼胶寡糖的酶类,具有广泛的应用范围.从海洋性高产琼胶酶菌株Flammeovirga sp. SJP92的发酵液经硫酸铵沉淀,DEAE 琼脂糖离子层析,分离纯化获得了一个分子量约为70KDa的琼胶酶AgaB.经过酶学性质分析,它的最适pH值为70,最适温度为40℃,在最适温度下能够保持较好的稳定性.进一步的分析表明, MgSO4和β Me对该酶有明显的促进作用,而CaCl2、MnCl2、ZnCl2、CoCl2、FeCl3、CuSO4等则会强烈抑制它的活性.此外,通过产物分析表明,该酶能够通过内切作用将琼脂糖最终降解成6糖和4糖.AgaB的分离纯化及其酶学性质分析为其工业应用奠定了基础.     

北冰洋海单胞菌β-D-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

初筛表明,一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌(Marinomonas sp.BSi20584)具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性,为了研究清楚其酶学性质,将经hiTAIL-PCR扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)与pET-28a(+)原核表达载体结合,转入大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表达条件进行了优化,采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶,并对重组GALT的酶学性质进行了研究。结果显示,重组酶的最适诱导温度为20℃,在IPTG浓度为0.07mmol/L时诱导22h后,酶活和产酶量达到最大值。GALT单体分子量约为6.6×104 g/mol,天然酶为同源三聚体。GALT最适作用温度为35℃,其热稳定性较好,在60℃处理5h后,仍可保持50%以上的相对活性。GALT的最适作用pH为9.0,在pH为6.0~11.0范围内比较稳定。GALT的最适NaCl浓度为0.5mol/L,对盐度具有较高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA对酶活不具有显著影响,而Mn2+、Fe2+对酶活有促进作用,Zn2+和L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT对Galβ1-4GlcNAc具有水解作用,而对Galβ1-3GalNAc和Galβ1-3GlcNAc糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达,并系统研究了重组酶的酶学特性,为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。     

海洋假单胞菌纤溶酶的酶学性质的研究

从一株海洋假单胞菌中分离制备出一种具有纤溶活性的酶 ,对其酶学性质进行实验研究结果显示 :该酶的分子量是 2 1k D,等电点是 7.4～ 7.5 ;最适作用 p H是 8.0 ,最适作用温度是 5 0℃。该酶具有降解苯甲酰 - L -精氨酸乙酯盐酸盐 (BAEE)的活性 ,酶的动力学分析表明 :Km =0 .87mmol/ L,Vmax=1.80× 10 -3 mmol/ L s-1。     

Bohaisea-9145海洋耶氏酵母碱性脂肪酶基因的克隆、异源表达和重组酶酶学性质

采用基因重组和分子生物学相关技术,对Yarrowia lipolytica Bohaisea-9145海洋低温碱性脂肪酶(Y.lipolytica Bohaisea-9145,LipYp)基因lipYp(1116bp)克隆并在Pichia pastoris中进行了异源真核表达研究。通过MD和MM平板及PCR扩增,筛选和鉴定了重组子。结果表明,阳性重组子经摇瓶发酵54h后上清液酶活力达到1956U/ml。发酵液经两步纯化得到在SDS-PAGE上显示为单一条带的重组脂肪酶。实验同时研究了不同反应温度、pH值对重组LipYp活力和稳定性的影响,结果显示重组LipYp最适反应温度和pH分别为35℃和8.5,在pH7.0-10.5之间以及45℃以下有较好稳定性。另外,重组脂肪酶对中长链对硝基苯基酯类和甘油三酯类(C10-C12)有较强的水解能力。     

南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5产α-淀粉酶Amy3809的表达、性质及其降解特性

对具有高淀粉酶活性的南极菌Pseudoalteromonas sp. A211-5的全基因组数据进行了分析和筛选,筛选获得α-淀粉酶疑似序列amy3809,并采用基因工程手段对该基因的功能和性质进行验证和分析。首先,以淀粉酶Amy3809的完整开放阅读框(ORF)为模板设计特异引物,克隆获得amy3809的全序列并对其进行重组表达,获得的重组蛋白采用镍柱进行分离纯化;DNS-还原糖法测定重组酶的酶学性质;薄层层析(TLC)技术对Amy3809的酶解产物进行分析。实验结果:1)克隆获得的amy3809成功地连接到pET-30a载体,并在工程菌E.coli BL21(DE3)中实现了高效表达,纯化的重组酶Amy3809分子量为67 kDa;2)重组酶Amy3809在10~40℃的范围内仍能保持85%以上的酶活,但随着温度的升高酶活迅速降低,70℃时几乎失活,表明该酶具有良好的低温耐受特性及热敏感性;3)最适pH为7.0,在pH 5.0~10.0的范围内仍能保持50%以上的活性;4)金属离子Na+,K+和Ca2+均能提高Amy3809的活性,而Cu2+,Fe2+,Mg2+和EDTA则能显著降低Amy3809的活性;5)Amy3809的酶解产物主要为麦芽四糖、麦芽三糖、麦芽糖和葡萄糖。由此可知,南极菌产的α-淀粉酶Amy3809,具有良好的低温耐受特性,热敏感性和较广的pH耐受范围,并能够有效地将淀粉降解为低聚糖和葡萄糖,因而具有潜在的工业应用前景。     

壳聚糖酶基因在解脂耶氏酵母中的表达及重组酶性质研究

为构建高效表达壳聚糖酶工程菌株,以Microbacteriumsp.基因组为模板扩增壳聚糖酶基因,目的基因与表达载体pINA1317连接构建重组质粒,重组质粒NotⅠ酶切线性化后转化解脂耶氏酵母Y.liPolytica Po1h。所得结果为PCR扩增得到约1000bp的特异性片段,序列分析表明含有壳聚糖酶全长基因,开放阅读框801bp,编码266个氨基酸残基。转化子酶活力为10.4U/mL,是原菌株酶活力的3.15倍。重组蛋白经DEAE-Sepharose FF分离纯化,达到电泳纯,SDS-PAGE显示单一条带,分子量约41kDa。重组酶反应最适温度为45℃,最适pH为5.6,Km和Vmax分别是0.926mg/mL和6.15U/mL。质谱分析酶解产物主要为三糖和五糖。实现了壳聚糖酶在解脂耶氏酵母中的分泌表达,为壳聚糖酶的工业化生产奠定了理论基础。     

海洋来源羽毛降解菌株的筛选、鉴定及酶学性质研究

微生物降解羽毛既可保护环境又能实现废物的资源化利用,具有显著的经济效益和社会效益。本研究从广西钦州港海鸭养殖淤泥筛选获得一株可高效降解羽毛的菌株Gxun-20,通过对该菌株形态特征、生理生化特性和16S rRNA基因序列进行分析,以确定菌株的分类,并对菌株产角蛋白酶的条件及酶学性质进行研究。结果表明：该菌为副短短芽孢杆菌(Brevibacillus parabrevis);菌株最适产酶条件为：温度34℃,初始pH 6.5,羽毛含量1.5%(质量分数),发酵48 h,角蛋白酶活性可达277.45 U/mL。菌株Gxun-20所分泌的角蛋白酶最适温度为50℃,且热稳定性较好,最适pH为7.5;金属离子Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺、Fe²⁺和Mn²⁺对酶活性有显著抑制作用,而Ca²⁺、Na⁺对酶活性有明显促进作用;金属螯合剂乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid, EDTA)可显著抑制酶的活性,蛋白...     

基于包埋法固定化漆酶的酶学性质及其催化氧化海水养殖废水中四环素的效能与途径

本研究以海藻酸钠、聚乙烯醇、明胶作为包埋材料,活性炭作为吸附剂,采用吸附-包埋法固定化漆酶,研究了游离漆酶和固定化漆酶的酶学性质,探讨了氧化还原介体类型及浓度、盐度对固定化漆酶降解四环素的影响,考察了四环素可能的降解途径。结果表明：与游离漆酶相比,固定化酶对pH和温度的变化表现出出色的适应能力,制备的固定化酶具有良好的热稳定性,60℃培养3 h后保留了其初始催化活性的76.31%,而游离漆酶仅保留不到20%的活性;4℃储存30 d固定化酶保留了51.41%的相对活性,表明固定化酶具有优异的储存稳定性。漆酶-SA系统在去除四环素(Tetracycline, TC)方面表现的更加优越,在3 mmol·L^-1丁香醛(Syringaldehyde, SA)存在的条件下,固定化漆酶对四环素的去除率为91.69%;盐度影响漆酶处理四环素的效果,但在30的盐度条件下,固定化酶能达到接近90%的TC去除率,满足水质净化的需要,漆酶催化氧化四环素的最佳pH为7。运用超高效液相色谱质谱联用仪,分析了降解产物,认为氧化、脱氢、脱甲基是漆酶氧化四环素的主要反应过程。     

南极衣藻（Chlamydomonas sp.ICE-L）谷胱甘肽还原酶基因的原核表达及其条件优化

采用RT-PCR技术克隆南极衣藻GR基因ORF全长cDNA,然后经酶切、连接等步骤构建其原核表达载体;并对其表达的诱导时间、IPTG浓度、温度进行了优化,以期获得较大量的酶蛋白。结果表明,将构建的原核表达载体pET-GR导入大肠杆菌BL21,可以高效表达融合蛋白;且表达的蛋白均以包涵体的形式存在;经SDS-PAGE电泳...     

织锦巴菲蛤(Paphia textile)过氧化氢酶基因cDNA全长克隆、序列同源分析与组织表达

Catalase is an important antioxidant protein that can protect organisms against various forms of oxidative damage by eliminating hydrogen peroxide. In this study, the catalase c DNA of Paphia textile(Pt CAT) was cloned using RTPCR and rapid amplification of c DNA ends(RACE). Pt CAT is 1 921 bp long and consists of a 5′-UTR of 50 bp, a 3′-UTR of 349 bp, and an ORF of 1 542 bp that encodes 513 amino acids with a molecular weight of 58.4 k D and an estimated isoelectric point of 8.2. Sequence alignment indicated that Pt CAT contained a highly conserved catalytic signature motif(~(61)FNRERIPERVVHAKGAG~(77)), a proximal heme-ligand signature sequence(~(352)RLFSYSDP~(359)), and three catalytic amino acid residues(H~(72), N~(145), and Y~(356)). Pt CAT also contains two putative N-glycosylation sites(~(34)NKT~(36) and ~(437)NFT~(439)) and a peroxisome-targeting signal(~(511)AQL~(513)). Furthermore, Pt CAT shares 53%–88% identity and 29%–89% similarity with other catalase amino acid sequences. Pt CAT m RNA was present in all tested organs, including the heart, digestive gland, adductor muscle, gonad, gill, and mantle, but its expression was highest in the digestive gland. High-temperature-induced stress produced two expression patterns of Pt CAT m RNA: first, an initial up-regulation followed by a down-regulation in the heart, digestive gland, and gonad and, second, consistent down-regulation in all other organs. These results demonstrate that Pt CAT is a typical member of the catalase family and might be involved in the responses to harmful environmental factors.     

一株源于红树林根际土壤产纤维素酶芽孢杆菌的鉴定及其酶学性质分析

从红树林根际土壤中筛选出一株产纤维素酶的革兰氏阳性菌,通过形态、生化特征及16S r RNA基因序列分析鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。对其产纤维素酶能力进行分析,发现该菌株所产纤维素酶的最适反应温度为55°C,最适p H为6。酶学性质分析发现,在反应温度为55°C时,该菌株产生的纤维素酶稳定性最好,保温120min后仍具有80%以上的相对酶活力;在p H为5—7时,酶活性相对稳定,相对酶活力均维持在80%左右。Cu~(2+)对该酶有一定的抑制作用,Zn~(2+)、Fe~(3+)、Mg~(2+)、Ca~(2+)、Fe~(2+)、Mn~(2+)和Co~(2+)均对酶有一定的促进作用。本研究显示这株芽孢杆菌具有良好的应用前景,为该菌株在水产饲料添加剂中的进一步研究与应用提供参考依据。     

白色噬琼胶菌QM38β-琼胶酶基因agaD02 的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。     

蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa) Rubisco活化酶基因的克隆与表达分析

采用RACE技术克隆了单细胞绿藻蛋白核小球藻820Rubisco活化酶基因(rca)序列,并用荧光定量PCR方法研究了rca和Rubisco小亚基基因(rbcS)的表达规律。结果获得了1703bp的rcacDNA序列,包括66bp的5’非翻译区、1242bp的开放阅读框和395bp的3’非翻译区。序列比较和分析表明该蛋白核小球藻rca序列与其它绿藻的同源性高达78%—85%;偏好使用以G/C/T结尾的密码子;推测的RCA蛋白等电点和分子量分别为8.44和45.71kDa。荧光定量PCR结果表明随光照时间增加rca与rbcS转录表达逐渐降低;不同盐度处理下rbcS的mRNA量变化不大,而rca在37.5盐度下表达量为25盐度的2.69倍;1.0—3.0mmol/L水杨酸处理rca与rbcS表达均降低。     

栉孔扇贝(Chlamys farreri)过氧化物酶体增殖物激活受体基因的鉴定与表达分析

过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome-proliferator-activated receptors,PPARs)是核激素受体超家族成员,在脂肪代谢过程中发挥重要的调控作用,目前贝类过氧化物酶体增殖物激活受体仍未见报道。本文利用已发表的栉孔扇贝(Chlamys farreri)基因组和转录组,获得其PPAR基因,命名为CfPPAR-like,基因开放阅读框全长1572 bp,编码486个氨基酸,预测蛋白质分子量MW为54305.3 Da,等电点pI为8.3,二、三级结构以转角和卷曲为主,无信号肽和跨膜区域,属于胞内蛋白。与脊椎动物PPARs蛋白序列比对表明CfPPAR-like包含DBD和LDB结构域,其中DBD区域保守性较高,而LBD的保守性较低。进化分析显示,栉孔扇贝等软体动物的PPARs聚为单独一支,仿刺参等棘皮动物的PPARs聚为单独一支,果蝇和线虫的PPARs基因同源物在进化树的最外端,脊椎动物的三种PPARs亚型分别聚类后,再与无脊椎动物PPARs聚类,结果支持核激素受体超家族在脊椎动物进化早期出现了各亚型这一假说。CfPPAR-like在幼虫发育过程中呈现普遍性表达,暗示其参与扇贝幼虫早期的分裂,贝壳的形成以及幼贝的变态过程;在成体各组织中,CfPPAR-like在栉孔扇贝的性腺、肾脏以及消化腺中表达量较高,表明其参与扇贝性腺分化、脂肪代谢等过程的调控。研究结果对于揭示贝类脂质代谢调控机制以及优良扇贝品种的培育具有重要意义。