不同培养模式对雨生红球藻细胞绿色生长以及虾青素积累的影响

研究了分批培养、pH反馈补料培养、定量补料培养与培养基完全更换培养4种培养模式对雨生红球藻绿色生长以及虾青素积累的影响。结果表明:当在绿色细胞阶段采用培养基完全更换的培养模式,能够有效的促进雨生红球藻细胞的分裂,同时藻细胞保持了较高活性。其中培养9d后藻细胞数目达到8.60E+05个/mL,游动细胞所占比例达到98.26%,细胞干重为1.12g/L,而且胁迫条件下培养10d后虾青素的产量达到53.21mg/L,明显高于其他培养模式。因此培养基完全更换培养是一种适合雨生红球藻生长与积累虾青素的培养模式。     

雨生红球藻诱变及筛选方法的研究

为获得性状优良的雨生红球藻藻株,满足雨生红球藻商业化生产的需求。本文探索了不同诱变方式以及不同筛选条件对雨生红球藻的影响,得到了γCo~(60)辐射和离子束诱变处理以及将喹禾灵和达草灭作为筛选压对雨生红球藻的致死率曲线。确定离子束照射时间75s和γCo~(60)辐射300Gy为雨生红球藻的适宜诱变条件。喹禾灵30.0μmol/L以及达草灭0.09mmol/L为雨生红球藻的适宜筛选压浓度。对诱变后藻株与对照藻株进行了生物量、干重以及虾青素含量的比较,最终筛选得到三株性状优良的突变株,生物量较未诱变藻株分别提升了16.2%、13.8%和20.4%,虾青素含量与未诱变藻株相比提升了20.7%、15.5%和6.7%。     

光照强度和温度对雨生红球藻生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响

本文探讨了光照强度和温度2个生态因子对雨生红球藻(Haematococcus plivialis)生长、虾青素及内源脱落酸积累的影响。研究表明,光照强度、温度及二者交互作用对雨生红球藻的生长、虾青素及内源脱落酸的积累均有显著影响(P0.05)。温度23℃时,细胞密度随光照强度的升高呈先上升后下降趋势,在200μmol/(m~2·s)时达到最大值4.9×105个/mL。适当的高光照强度和高温均能促进雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的积累,过高则起抑制作用。培养期间雨生红球藻中虾青素和内源脱落酸的最大峰值分别为6.266mg/L和322.641ng/g(干重),且最大峰值均出现于27℃、200μmol/(m~2·s)处理组。脱落酸含量的最大值出现在虾青素快速积累前,且在雨生红球藻的生活周期中,孢囊形成期的内源脱落酸含量最高。本研究所得到的规律对规模化培养雨生红球藻具有一定的指导意义。     

光照与温度对紫外筛选盐生杜氏藻藻株的生长及色素积累的影响

利用紫外线诱变方法进行盐生杜氏藻(Dunaliella salina)的藻种选育,并研究了所选择的3株诱变株(OUC21,OUC36,OUC66)对光照和温度的反应.结果表明,光照实验中诱变株和出发株(BJ38)的生长与β-胡萝卜素积累的最适光照强度相同,都是0.88×104 lx,此光强下诱变株的生长速率要高于出发株,其中OUC36生长速率最快,藻细胞密度比出发株高25%;3株诱变株中只有OUC36单位体积藻液中β-胡萝卜素的积累量(10.76 mg/L)高于出发株(10.10 mg/L),而OUC21(6.68 mg/L)则低于出发株,各光强下3株诱变株单位体积藻液叶绿素的积累量都高于出发株.诱变株与出发株在最适生长温度上表现出差异性,出发株生长的最适温度为22℃,诱变株OUC66与之相同,而OUC21和OUC36生长的最适温度是28℃,实验中同一温度条件下诱变株的生长速率高于出发株,最大的也是OUC36;适于β-胡萝卜素积累的温度诱变株与出发株相同,都是22℃,3株诱变株中同样是OUC36单位体积藻液中β-胡萝卜素积累量(7.9 mg/L)最大,略高于BJ38(7.84 mg/L),而OUC21(5.31 mg/L)最低,各温度下诱变株单位体积藻液中叶绿素含量高于出发株.OUC36具有生长速率快和积累β-胡萝卜素能力强的优点,可能成为适用于大规模培养的藻种.     

温度、光照强度和pH对雨生红球藻光合作用和生长速率的影响

采用测定净光合放氧速率的方法研究了温度、光照强度和pH对 4株雨生红球藻光合作用和生长繁殖速率的影响。结果表明 ,温度、光照强度和pH对雨生红球藻的光合作用和生长速率的影响十分显著 ;4株雨生红球藻光合作用的最适温度、光饱和点和pH分别为 :Haematococcuspluvialis 2 6 :1 5℃ ,2 5 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococcuspluvialis 3 0 :2 0℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH8 0 ;Haematococcuspluvialis 3 4 :1 5℃ ,2 0 0 μmol/(m2 ·s)和pH7 0 ;Haematococ cuspluvialisWZ :1 0℃ ,1 40 μmol/(m2 ·s)和pH6 0。雨生红球藻细胞数量的增加与光照时间成正比。初步认为H pluvialis3 0、H pluvialis2 6和H pluvialisWZ是 3个有潜力适合于大规模生产的藻种。     

不同碳氮浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响

研究了不同二氧化碳浓度和硝酸钾浓度对雨生红球藻生长及虾青素累积的影响。结果表明,较高浓度的CO2(600×10-6)能够显著促进雨生红球藻的生长、光合作用的进行和虾青素的累积。红球藻单个细胞内的虾青素含量随着培养液中硝酸钾浓度的降低而增加,绿色游动藻种和绿色不动藻种培养12 d后获得的最大虾青素值分别为10.93 pg/个和12.64 pg/个。连续通气是促进雨生红球藻生长及虾青素累积的一种有效碳源提供方式。     

利用光生物反应器培养雨生红球藻的研究初探

用光生物反应器与光照培养箱两种培养容器培养雨生红球藻(Haematococcus pluvialis),对雨生红球藻在两种容器培养过程中细胞生长、pH值、溶解氧(DO)及虾青素积累情况进行比较,同时比较不同接种密度对光生物反应器培养效果的影响。实验表明,光生物反应器中藻细胞的调整期较短,接种1 d后即进入指数生长阶段,在胁迫阶段则仅需4 d即达到虾青素含量的峰值;将pH值控制在偏碱性条件下(7.75±0.10)有利于藻细胞更好生长;营养培养阶段DO相对饱和度上升至80%,而在胁迫阶段则迅速降低,最低值小于6%;较高的接种密度(2.3×104个/mL)具有较短的营养培养周期(7 d),且因接种密度变化对胁迫周期长短无明显影响(均为4 d),选用较高的接种密度可望降低工业生产成本。     

LED灯的光照对雨生红球藻细胞生长及虾青素积累的影响

为提高雨生红球藻的生物量以及细胞内虾青素的积累量,通过不同光源、不同光照强度照射培养藻细胞。研究表明,在总光强为2500lx,红光与白光的强度比例为2:1时,雨生红球藻干重可以达到0.98g/L,比单独使用白光和红光照射下分别提高了36.11%和15.91%。在雨生红球藻转化产虾青素阶段,对比蓝光LED、目光灯以及两者的组合光源照射转化的结果,发现在总光强为7000lx,蓝光与白光的强度比例为3:1时,雨生红球藻中虾青素的积累量为39.79mg/L,明显高于单独使用白光与蓝光转化下的产量。     

亚硝基肌(NTG)对雨生红球藻的诱变效应

用浓度分别为0，0．5，1，1．5，2，2．5，3，3．5g／L的亚硝基胍(NTG)处理雨生红球藻(Haematococcus Pluvialis)，处理后的藻细胞分别置于100mL三角烧瓶培养，3d后用细胞计数测定抑制率。结果表明，NTG浓度为2．5g／L时生长K值最大，为0．389；藻液的细胞干质量最大．为0．711g／L；虾青素含量也最多，为1．86975 mg／L，之后随着浓度的增加反而下降。     

红球藻藻株对光强适应及在工程培养中的应用

于2007～2008年在云南楚雄,利用叶绿素连续荧光分析等技术方法,对比研究了3株雨生红球藻藻株(Haematococcus pluvialis)(H_0、H_2、H_3)不同类型细胞对光强适应能力和光化学机制、生长速率和虾青素累积情况,对比研究了红球藻细胞转化过程的光化学特性与能量分配机制。结果表明,3株雨生红球藻游动细胞、绿色不动细胞和红色不动细胞光合作用对光强需求存在明显差异性,其中绿色游动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、1000、750 μmol/(m~2·s),绿色不动细胞H_0、H_2和H_3光饱和点分别为750、750、500 μmol/(m~2·s),而红色不动细胞H0、H_2和H_3的光饱和点分别为500、750、500 μmol/(m~2·s)。上述数据意味着红球藻光合作用对光强需求以游动阶段细胞最高,其次为绿色不动细胞,而红色不动细胞对光需求最弱;3株红球藻光合作用对光强需求的顺序为H_2H_0H_3。从实际培养效果来看,H_0藻株游动细胞在9月、11月到次年5月生长最好,其中4月、11月比生长速度为藻株H_3的2.19倍和2.17倍,而在6～8月和10月份中,藻株H_2生长比较迅速,但是藻株之间差异性相对较小。针对3株红球藻虾青素累积而言,1～2月、4月、6月、9月、11～12月藻株H0的虾青素含量最高,3月、5月更适宜H_3积累虾青素,其余7～8月和10月H_2藻株积累虾青素更多。综合雨生红球藻细胞生长和虾青素累积二个决定产量的主要因素,作者认为,在秋末、冬、春和夏初等温度和光照相对较低季节,选择藻株H_0规模化培养可获得更好的生产效果,而在光照较强、温度较高和多雨的夏季和秋初季节,应选择藻株H_2培养产量更高。     

雨生红球藻中IPP异构酶基因表达调控机制的初步研究

单细胞淡水绿藻-雨生红球藻能够在一定条件积累一种次生类胡萝卜素-虾青素,因而在生长后期藻体变为深红色。其中,IPP异构酶在雨生红球藻中的虾青素合成过程中发挥了重要作用。在本研究中,我们首次通过基因组上游步移克隆到了雨生红球藻中IPP异构酶基因的两个不同5’上游侧翼序列,大小分别是1．8kb和2．5kb。利用生物信息学方法分别对这两个不同5’上游侧翼序列进行了序列分析,结果发现,二者具有某些相同的顺式作用元件,如可能的脱落酸反应元件（ABRE）、干燥或低温反应元件（DRE／C-repeat）、几种光反应元件（G-box,GAG-motif,I-boxand ATC-motif）、热激反应元件（HSE）、机械伤害反应元件（WUN-motif）、水杨酸反应元件（TCA-element）、生长素反应元件（TGA-element）、茉莉酸甲酯反应元件（TGACG-element）、缺氧特异反应中的增强子类似元件（GC-motif）和反式作用因子MYB蛋白的结合位点（MBS and MRE）,但是二者并不具有典型的TATA框和CCAAT框。上述研究预示了雨生红球藻虾青素合成中IPP异构酶基因转录调控方式的多样化。     

稀土元素Ce对雨生红球藻生长及虾青素积累影响的研究

采用反相高效液相色谱分析法（RP-HPLC）研究了稀土元素铈（Ce^3＋）对雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）生长及虾青素积累的影响。结果表明,低质量浓度的Ce^3＋对微藻生长和虾青素积累均具有明显的促进作用,当Ce^3＋的质量浓度为0．1mgm时,对藻生长的促进效果最佳,细胞密度较对照组提高34％;当Ce^3＋的质量浓度为1mg/L时,虾青素质量分数可达到细胞干质量的3．2％,较对照组提高167％。此外,高质量浓度Ce^3＋的对雨生红球藻有抑制作用,当Ce^3＋的质量浓度高于40mgm时,红球藻的生长完全被抑制,虾青素质量分数也明显降低。     

雨生红球藻中crtO基因存在3个5’上游侧翼序列

在本研究中,我们首次通过基因组上游第一次步移克隆到了雨生红球藻中crtO基因的3个不同大小的5’上游侧翼序列1．1kb,1．9kb和2．2kb。利用生物信息学方法分别预测并比较了这3个不同大小的5’上游侧翼序列,结果发现,三者具有与高等植物相类似的顺式作用元件,如脱落酸反应元件（ABRE）、干燥或低温反应元件（DRE／C-repeat）、几种光反应元件（G1-box,GAG-motif,l-boxand ATC—motif）、热激反应元件（HSE）、机械伤害反应元件（WUN-motif）、生长素反应元件（TGA-element）、茉莉酸甲酯反应元件（TGACG-element）和反式作用因子MYB蛋白的结合位点（MBSandMRE）等等,但是三者并不具有典型的TATA框和CCAAT框。上述研究预示了雨生红球藻虾青素合成中crtO基因调控方式的多样化。     

利用雨生红球藻生产虾青素的研究进展

作为天然虾青素的最佳生物来源，雨生红球藻已成为近年来国内外微藻研究的热点之一．本文综述了国内外雨生红球藻培养及虾青素积累的研究进展，介绍了国外天然虾青素商业生产的现状，并对现存的主要问题和发展方向做出阐述，以期推动国内利用雨生红球藻生产虾青素的商业化进程。     

雨生红球藻的细胞周期初探

于１９９７年在青岛利用显微镜连续观察技术研究了雨生红球藻的细胞繁殖方式和动力学。结果表明,该藻细胞周期分为流动和不动２个阶段。每一阶段主要以无性生殖产生孢子的方式完成增殖。正常条件下游动细胞主要产生２、４个,偶尔产生２、４个,偶尔产生８个游动孢子,游孢子从孢子囊释放后为游动细胞。环境不适时流动细胞以及流动孢子失去鞭毛转入不动阶段。不动细胞主要形成４、８个,偶尔也能形成２０多个不动孢子,该过程不一定     

雨生红球藻铁型超氧化物酶基因的克隆与序列分析

利用已报道的FeSOD保守区域,设计简并引物,通过简并PCR的方法获得了雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)FeSOD(HpFeSOD)cDNA的部分序列,然后采用RACE方法分别克隆到5′端和3′端。拼接后得到HpFeSOD cDNA全长,该基因全长为1 138 bp,ORF为684 bp,编码227个氨基酸。把已经得到的HpFeSOD序列推导成氨基酸序列与一些已知物种的FeSOD氨基酸序列相比较,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻、衣藻、团藻、石莼、颤藻的同源性为89%、83%、78%、70%和63%。分子系统学分析表明,雨生红球藻FeSOD与杜氏藻FeSOD聚在一起,介于真菌与高等植物之间并且真核微藻FeSOD与高等植物的同源性更高,推测其在进化上与高等植物的亲源关系更近。     

雨生红球藻脂肪酸组成和含量的气相色谱分析

以正十九碳酸(C19：0)为内标,用HCI-CH3OH溶液提酯化雨生红球藻后进行毛细管气相色谱分析。通过正交实验确定抽提和酯化雨生红球藻脂肪酸的最佳酯化酸度、超声破碎时间和水浴时间。该法对雨生红球藻游动细胞脂肪酸含量测定的相对偏差为0．4％～9．5％;对雨生红球藻孢子为3．0％～11．8％。仪器的检测限为0．942μg。结果表明,雨生红球藻绿色游动细胞的饱和脂肪酸组分主要是C16：0,含量为2．22％;不饱和脂肪酸主要有C16：1,C18：2,C18：1和C18：3,含量在0.764％～3．28％。雨生红球藻孢子中的饱和脂肪酸主要有C16：0和C18：0,含量分别为4．34％和0．477％;不饱和脂肪酸主要为C16：1,C18：2,C18：1和C18：3;含量在0．901％～8．20％。     

雨生红球藻的信号物质

以单细胞雨生红球藻为材料，在室内通气培养条件下，研究了经该藻处理过的培养液内是否存在对细胞生长或转化产生影响的信号物质。对比研究结果表明，处理过的旧液明显不利于红球藻游动细胞生长，但有利于不动细胞增加。预显着旧液中可能存在着降低游动细胞生长、同时还促使游动细胞向不动细胞转化的信号物质。旧液中该信号物质的多少与原来处理旧液的藻细胞密度有密切关系，密度越大信号物质越多，对细胞生长和转化的作用也越强。     

雨生红球藻细胞转化、虾青素积累与光照强度的关系及不同品系间的差异性

于2004年利用3个品系的雨生红球藻(H0、H2和H3)和以去除营养物质的藻液为实验对象,探讨了光强对细胞转化和虾青素积累的影响。结果表明,光照强度对红球藻虾青素积累和细胞转化有显著影响,并在品系间存在一定差异性。其中:品系H0在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在20000～35000lx时虾青素积累量处于较高水平,而光照强度>35000lx时,虾青素积累量随光强的升高而下降;H2品系在光强≤25000lx时虾青素积累量随光强的增加而增加,光强在25000lx左右时虾青素积累量较高,当光强≥35000lx时,虾青素积累大幅度下降;H3品系在≤35000lx时虾青素积累量随光强的升高而增加,20000~45000lx为虾青素积累较适宜的光强,高于45000lx时虾青素积累量则明显下降。进一步分析得出,弱光导致红球藻虾青素含量较低是光照强度不足、细胞内虾青素含量少的结果,而强光下虾青素含量下降则是细胞受到损伤、细胞数量减少导致的。对比研究发现:在较低光强下(20000~25000lx)H2单个细胞内虾青素积累量略低于H0,但其积累虾青素总量却最高,这是由于此时H2不动细胞增长速率比其它品系高造成的,不过适宜H2积累虾青素的光照范围最窄,它对高光强的耐受性也最差;而H3在较低光强下虾青素积累总量及单个细胞内的积累速率均最低,但是它的适宜光照范围最宽,即对高光强的耐受性最强,在较大的光强波动范围内都可以保证较高的安全转化量,这就使得它在较高的光强下虽然单个细胞积累虾青素的速率仍然最低,积累总量反而显著高于其它两个品系。