养殖牙鲆淋巴囊肿病流行状况与组织病理学研究

１９９７～１９９８年,山东省烟台市和威海市４个养殖场的养殖牙鲆发生了一种危害很大的疾病。该病症状为患病牙鲆的眼睛、口腔内外、鳍及上下体表等部位有明显囊肿物。病症轻的牙鲆援食正常且有自愈现象,病症重的牙鲆基本不摄食、部分出现死亡。自愈牙鲆体质弱,在运输过程中死亡率超过了８０×１０－２,可以说失去了商品价值。据调查,发病养殖场的鱼苗系购自同一育苗场,而该育苗场则使用了韩国亲鱼进行鱼苗生产。病理组织切片表明,在囊肿细胞的胞质内有嗜碱性、具网状结构、形状不规则的包涵体。由于本病的症状和病理组织特征与国内外有关真鲷和石斑鱼等的报道基本一致,所以,本研究初步认为该病为淋巴囊肿病。     

养殖牙鲆淋巴囊肿病的电镜观察

对养殖牙鲆中发生的似淋巴囊肿病进行了细 胞的电镜超微结构观察。结果指出,在囊肿细胞内有大量形态一致、大小为260～270nm的典 型虹彩病毒。因病毒的形态和大小与国外报道的淋巴囊肿病毒相同,故研究从电镜学的角度 确认供试牙鲆所患疾病是淋巴囊肿病(Lymphocystis disease,LD),该病毒为虹彩病毒科的 淋巴囊肿病毒(Lymphocystis disease virus,LDV)。该项工作系国内首次全面报道了病鱼主 要组织细胞的电镜观察结果,发现LD病毒存在于囊肿、心脏、头肾、脾脏、肠和鳃中。     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4，通过间接酶联免疫法（ELISA）对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒（LCDV）特异性抗体进行了检测。结果表明：无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低（平均OD值为0．092），个别鱼体偏高，证明已感染LCDV，处于潜伏期；患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高（平均OD值为0．165），患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高（平均OD值为0．231）；健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后，特异性抗体水平显著升高。．     

利用牙鲆鳃细胞系分离和培养淋巴囊肿病毒

本文利用牙鲆鳃细胞系进行了养殖牙鲆淋巴囊肿病毒的分离及培养 ,并通过电镜对培养细胞中淋巴囊肿病毒的形态及感染循环进行了初步研究。将病鱼的淋巴囊肿组织无菌滤液接种牙鲆细胞系 ,细胞出现了明显的细胞病变 ( Cytopathic effect,CPE)。电镜观察在培养细胞的胞质中有病毒的包涵体 ,胞质中散在 6角形、5角形或圆形的病毒粒子 ,大小为 10 0～ 140 nm之间。在感染细胞的线粒体中也存在大量的病毒颗粒。     

牙鲆淋巴囊肿病自愈过程中细胞因子的表达研究

中国北方养殖牙鲆的淋巴囊肿病一般发生在水温较低的10～12月,之后随水温的升高肿瘤脱落、出现自愈现象.搞清自愈机理.是有效抑制和减少淋巴囊肿病的重要科学内容.本文研究了不同饲育水温下健康和患淋巴囊肿病牙鲆细胞因子的表达变化,仞步探讨了细胞因子在肿瘤自愈中的作用.通过模拟养殖中的水温变化,采用荧光定量PCR(re-al-time fluorescence quantitative PCR)技术.检测了14,18,22和26℃下牙鲆肝、脾、头肾组织中6种细胞因子(白细胞介素1β(1L-1β)、Mx蛋白(Mx)、肿瘤坏死因子(TNF)、肿瘤坏死因子受体(TNFR)、趋化因子(IL-8)和趋化因子受体(IL-8R))表达变化.结果表明.患病牙鲆肝、脾、头肾组织中的IL-8、IL-8R、Mx、IL-1β、TNF和TNFR-1表达量随温度升高而显著升高;健康牙鲆上述细胞因子的表达基本未出现随温度升高而显著上升的现象.本试验结果响应了养殖水温升高肿瘤脱落的现象,提示上述细胞因子在淋巴囊肿病自愈过程中可能发挥了抗病毒作用.     

应用单克隆抗体检测牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒的特异性抗体

应用杂交瘤单克隆抗体技术制备10株分泌抗牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞。利用单抗2H4,通过间接酶联免疫法(ELISA)对牙鲆血清中抗淋巴囊肿病毒(LCDV)特异性抗体进行了检测。结果表明:无外观症状的牙鲆血清中特异性抗体水平很低(平均OD值为0.092),个别鱼体偏高,证明已感染LCDV,处于潜伏期;患淋巴囊肿病且症状显现的牙鲆血清中特异性抗体水平升高(平均OD值为0.165),患淋巴囊肿病后处于恢复期的牙鲆抗体水平最高(平均OD值为0.231);健康牙鲆接种LCDV灭活疫苗后,特异性抗体水平显著升高。     

海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的初步研究

在 1996年调查的基础上 ,首次报道了浙江海水网箱养殖鲈鱼淋巴囊肿病的发病情况 :发病季节在 6～ 8月 ,1龄鱼苗发病率 70 %,死亡率 30 %。电镜观察表明 ,体表和鳍上的疣状物主要由淋巴囊肿细胞组成 ,细胞内充满虹彩病毒颗粒。肝细胞和肠上皮细胞内没有发现病毒颗粒 ,但溶酶体数量增多 ,肝细胞结构有部分损伤。本文还描述了虹彩病毒在肥大细胞内的增殖过程。     

鱼类淋巴囊肿病毒靶器官的组织病理研究

探讨病毒传播途径,运用组织病理学技术,对患淋巴囊肿病毒病的牙鲆和鲈鱼的组织进行显微观察,并对病毒感染的靶器官进行了研究。结果表明,在牙鲆体表皮下结缔组织中,当大量成纤维细胞膨大、变圆,大小为10~18μm时,细胞膜外未出现囊壁,少数细胞的细胞质中观察到嗜碱性物质;18~20μm的膨大细胞在细胞膜外出现囊壁,细胞质内出现嗜碱性物质;>20μm的细胞具有了淋巴囊肿细胞的典型特征。另外,在牙鲆鳃、肠上皮下结缔组织和粘膜下层中,脾、头肾边缘组织和表面系膜、肝表面系膜,以及鲈鱼的鳃等部位均观察到淋巴囊肿细胞,并在牙鲆和鲈鱼脾内观察到膨大细胞。因此,淋巴囊肿病毒的靶器官主要是鱼体表皮下结缔组织,其次是鳃、体腔膜、肠、脾和头肾。鱼体表皮下结缔组织是淋巴囊肿病毒病的检测、检疫和早期诊断的最佳样品。     

牙鲆工厂化养殖技术

牙鲆是荣成市工厂化养殖的重要鱼类品种。邱家渔业公司在多年牙鲆养殖的基础上,总结出了一套有益的经验,他们从3厘米～5厘米大小的牙鲆鱼苗养成至20厘米以上的牙鲆鱼,只用7个月的时间,并且鱼的养殖成活率达60％,基本上达到了国内较先进水平。现将他们的主要做法介绍如下:     

牙鲆鱼苗长途运输技术的试验研究

本实验对10个批次，总数为19047尾的不同规格和产地的牙鲆鱼苗长途运输效果进行了研究。结果表明，规格为9-12cm的鱼苗，在水温6－12℃，运输时间为35－50h，采用空运和低温活水车运输，运输死亡率为664尾，死亡率为3.39%，低温活水车短途运输是可行的，尽管长途车运方式成本较低，但由于应激强度较大，对鱼苗的生长性能影响较为严重，驯养10d累计死亡率最高达18.1%，这种模式不可取。低温（6℃）、小规格（9cm)的空运较适合牙鲆鱼苗长途运输。此外，本文还就运输应激反应、预防措施和药物防治进行详细的讨论。     

摄食水平对褐牙鲆(Paralichthys olivaceus) 幼鱼生长影响的初步研究

褐牙鲆幼鱼 (体重 0 .71～ 4 .16 g;体长 4 .4 5～ 8.14cm)在 2 4℃下保持 5个摄食水平 (0～最大 )。投喂人工配合饵料。湿重、干重、蛋白质及能量的特定生长率与摄食水平呈线性关系 ,相关系数分别为 0 .886 4 ,0 .8311,0 .80 16和 0 .8577(n=33,p<0 .0 5)。随摄食水平增加 ,干重、蛋白质和能量的转化效率升高 ,平均总转化效率分别为 33.77%、33.89%和 33.0 3%。     

微生态制剂对牙鲆非特异性免疫因子影响的研究

以牙鲆为试验材料,在基础饲料中分别添加5种不同配伍的微生态制剂,以基础饲料为对照,饲喂60 d。定期测定牙鲆血细胞吞噬活性及血清中的抗菌活力、溶菌活力、超氧化物歧化酶活力。结果表明,添加0.4%N3 E5微生态制剂对吞噬活性促进作用最为显著;添加N3微生态制剂对血清中抗菌活力和溶菌活力的促进作用尤为显著;第40天,添加了N3、E5、N3 E5和枯草芽孢杆菌组,溶菌活力分别比对照组提高了195.2%,222.7%,153.0%,113.6%;此外,几种微生态制剂对超氧化物歧化酶也有一定的促进作用。60 d后,用鳗弧菌进行攻毒试验,试验组的免疫保护率分别达到43.4%,71.6%,40%,62.2%,20%,表明所用微生态制剂可以促进牙鲆的非特异性免疫功能。     

基于核磁共振的褐牙鲆幼鱼组织代谢组学分析

基于核磁共振的代谢组学技术是系统生物学研究的重要组成部分,近年来已被广泛应用于海洋生物学中。由于海洋环境具有高盐度的特点,海洋生物与其他生物相比,体内代谢物浓度差异极大。通常来说,海洋生物为应对高盐度的海水环境,其体内的渗透调节物,例如牛磺酸、甜菜碱、氮氧三甲胺等的浓度往往是其他代谢物的数百倍,造成体内代谢物所占代谢组权重的极不均衡。因此,选择合适的代谢组数据预处理方法,是准确分析海洋生物代谢组差异的关键。本研究以褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼鱼为研究对象,经低盐胁迫48小时后,利用一维核磁共振氢谱,分析了褐牙鲆幼鱼全组织在低盐胁迫后的代谢组变化,比较了三种不同预处理方法 (单位方差换算、帕莱托换算与对数化-中心化处理)对于低盐胁迫诱导的代谢响应分析的差异。结果表明,褐牙鲆幼鱼体内的渗透调节物-氮氧三甲胺浓度是其他代谢物浓度的200倍以上,而低盐胁迫可诱导褐牙鲆幼鱼体内显著的代谢响应。其中,对数化-中心化处理的代谢组数据,经正交偏最小二乘判别分析后,能发现8个低盐胁迫诱导的差异代谢物(不含1个未知代谢物),与代谢物定量结果一致,多于其他两种预处理方法 (单位方差换算、帕莱托换算)的代谢组分析结果,适合用于褐牙鲆代谢组学分析。以上研究结果为褐牙鲆代谢组数据的准确分析提供了方法学依据。     

养殖牙鲆脑垂体的显微和超微结构观察

应用多种脑垂体组织学染色方法、免疫组织化学和电镜技术对养殖牙鲆脑垂体各个部分的组织结构进行较详细的研究.结果表明,牙鲆脑垂体呈鸡心形,可分为神经垂体和腺垂体两个部分.前者存在两种垂体细胞:颗粒垂体细胞(granular-pi-tuicyte)和纤维垂体细胞(fibrillar-pituicyte).后者又可区分为前腺垂体(RPD)、中腺垂体(PPD)和后腺垂体(PI),根据组织学染色和免疫组织化学识别以及对各种分泌细胞分泌颗粒直径的测定,在腺垂体可鉴别出六种不同形态和功能的内分泌细胞,其中位于RPD的有催乳激素(PRL)细胞、促肾上腺皮质激素(ACTH)细胞和促甲状腺激素(TSH)细胞,各自分泌颗粒的直径分别为150~360nm、120~300nm和125~250nm;PPD有生长激素(GH)细胞、促性腺激素(GTH)细胞,分泌颗粒直径分别为200~400nm和115~400nm,以及TSH细胞;PI只有黑色素细胞刺激素(MSH)细胞,分泌颗粒直径为250~475nm.值得指出的是,在六种内分泌细胞中唯有GTH细胞的胞质存在空泡,这是促性腺激素细胞释放分泌颗粒的标志,也是其重要的生理特征,以此为依据将可为研究牙鲆脑垂体对性腺发育的调节提供形态学依据.同时,本文对其它细胞的特点也进行了讨论,可为鱼类内分泌学研究增添新的资料,对牙鲆人工养殖和繁育的开展有重要的参考价值.     

褐牙鲆鳃丝Na+-K+-ATPase性质的研究

研究了褐牙鲆 (Paralichthysolivaceus)鳃丝Na K ATPase的性质。结果表明 :褐牙鲆鳃丝Na K ATPase活力随着反应温度、pH的增加均呈现峰值变化 ,其最适反应温度为 3 0～ 3 5℃ ,高于 40℃酶活力急剧下降 ,至 5 0℃酶失活 ,而最适pH为 7.5～ 8.0之间 ,pH <7.5或 >8.0时酶活力急剧下降 ,低于 6.0酶活则被完全抑制 ;在本试验设计的反应时间和底物浓度范围内 ,随着时间和底物浓度的增大 ,酶活力的变化均为逐渐升高 ,且上升趋势逐渐变缓 ;反应介质中Na ,K ,Mg2 的最适浓度分别为 180 ,3 0 ,6mmol/L ,并且当K 或Mg2 浓度为 0时 ,酶活力均接近于 0。抑制剂乌本苷对鳃丝Na K ATPase活力表现为显著性抑制 ,在乌本苷浓度为 2mmol/L时 ,酶活力完全被抑制。     

牙鲆发育中ALP基因表达图式及功能分析

为探讨研究碱性磷酸酶（ALP）在牙鲆发育变态中的表达与功能，采用组织学和分子生物学的方法对牙鲆ALP进行了研究。结果如下：1．组织化学染色显示原肠期胚体中即可以检测到ALP的活性。出膜后，在头和背部的活性比较强，而身体的内脏区域，活性较低，卵黄中没有表现出酶活性。仔鱼进食后，ALP开始在消化道中大量的表达，特别是在胃肠道粘膜层。2．牙鲆ALPcDNA全长为1811bp，预测能编码476个氨基酸的蛋白质。采用RT-PCR的方法在牙鲆卵到出膜后5天的时候不能检测到ALP基因表达，到变态前的仔鱼体内开始表达。在成鱼胃、肝、鳃、皮肤、皮下肌肉、肾中均能检测到ALP的表达。3．变态前的仔鱼身体总ALP活力约为出膜时的卵中酶活力的4倍，在变态期酶活力变化不大，但是在变态后期上升明显。甲状腺素（T4）在变态中对酶活力增加有明显的促进作用。作为甲状腺素合成抑制剂，硫脲（Tu）能降低仔鱼体内酶活性。4．使用ALP的活性抑制剂左旋眯唑（TRM）处理的仔鱼消化功能和头部骨骼的发育受到一定的影响。消化道内食物很少，消化道上皮层中ALP免疫显色反应减弱。头部骨骼中发现较多骨细胞死亡而只留下一些细胞碎片，超过95％的仔鱼不能完成右眼的移位就发生死亡，变态比对照组迟缓。5．定量PCR结果表明，变态中期ALP基因表达量只有初期的1／2，变态后期却明显上升到变态初期的2．5倍，T4和Tu处理对ALP基因表达产生影响的在中期和后期表现明显。中期T4组明显高于对照组和Tu组，变态后期T4组和Tu组均低于对照组。