三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)I 型Crustin抗菌肽的基因克隆与真核重组表达

Crustin 是目前报道广泛存在于甲壳类中的一类具有广谱抗菌活性的抗菌肽, 主要由甲壳类血淋巴细胞合成。本研究采用RACE 技术和真核表达技术, 进行了三疣梭子蟹Crustin 基因的克隆和重组表达研究。结果表明, 在三疣梭子蟹血细胞Crustin 基因cDNA 全序列中, 开放阅读框编码110个氨基酸残基的Crustin 前体, Crustin 前体由N 端21 个氨基酸残基的信号肽、富含Cys 结构域和C端WAP 结构域三部分组成, 属于I 型Crustin, 构建的分泌型真核表达质粒pVT102U/α-crustin 转化酿酒酵母S78, 经RT-PCR 和SDS-PAGE 电泳验证, 表明重组Crustin 表达成功。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Pthyastatin抗菌肽基因的克隆与表达分析

采用构建三疣梭子蟹血细胞全长cDNA文库的方法克隆了一个新型抗菌肽基因Pthyastatin,并用荧光定量RT-PCR方法,进行Pthyastatin的表达研究。结果表明,Pthyastatin前体由16个氨基酸残基的信号肽和成熟肽两部分组成,其中Pthyastatin成熟肽有两个结构域:N端的富含Pro/Arg结构域和C端的包含6个保守Cys残基与对虾抗菌肽penaeidins同源的结构域,表明Pthyastatin属于对虾抗菌肽penaeidins家族;荧光定量RT-PCR分析结果表明Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达;致病菌副溶血弧菌诱导后Pthyastatin在血细胞中表达先下调、后上调,在诱导后24h表达量又基本恢复到诱导前水平,支持Pthyastatin在血细胞中高水平组成型表达的观点,但致病菌诱导后表达变化机制不明。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因克隆及其表达分析

本研究克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)胞内氯离子通道蛋白基因,命名为Pt CLIC。该基因c DNA全长2000bp,5’和3’非编码区(UTR)长分别为76bp和1162bp,开放阅读框长762bp,推测编码253个氨基酸,预测分子量为29.2k Da,理论等电点为5.93。生物信息学分析表明,Pt CLIC基因中未发现跨膜结构域,属于不稳定蛋白;同源性分析表明,Pt CLIC基因编码的氨基酸序列与蚤状溞(Daphnia pulex)CLIC基因的同源性高达83%;系统进化分析表明,三疣梭子蟹与拟穴青蟹首先聚为一支;实时荧光定量RT-PCR分析表明,Pt CLIC基因在选取的所有组织中均有表达,在肝胰腺中的相对表达量最高,且显著高于其它组织(P0.05)。低盐度胁迫显著改变了Pt CLIC基因在三疣梭子蟹鳃和肝胰腺中的表达模式,整体呈先上调后下调的趋势,并发现该基因在低盐耐受和低盐敏感家系中的表达规律差异显著。研究结果表明Pt CLIC基因在三疣梭子蟹渗透压调节中发挥重要作用,可辅助三疣梭子蟹耐低盐品系的选育。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)RXR基因克隆及其在蜕皮过程中的表达分析

本研究通过转录组测序和RACE技术克隆了三疣梭子蟹类维甲酸X受体2(PtRXR2)基因cDNA全长(登录号:KF914662),并通过荧光定量PCR(qRT-PCR)技术研究了该基因在三疣梭子蟹不同组织及不同蜕皮阶段的表达情况。结果表明,(1)PtRXR2基因cDNA全长1718bp,包括5’非编码区(5’-UTR)141bp、3’-UTR 209bp和开放阅读框1368bp,编码455个氨基酸,预测分子量和等电点为49.75kDa和6.79。(2)PtRXR2推导氨基酸序列的Blastp结果显示,PtRXR2与已知甲壳动物RXR的一致性为74%—99%,系统进化树分析表明PtRXR2与其它甲壳动物RXR聚为一支。(3)qRT-PCR结果显示PtRXR2在C期三疣梭子蟹Y器官、鳃、眼柄和大颚器中表达水平较高,肝胰腺中的表达水平最低。其它6个组织中的表达水平居中。(4)不同蜕皮阶段,PtRXR2在Y器官、眼柄和胸神经中均是AB期表达水平最高,E期最低,这可能与上述器官的细胞增殖主要发生在AB期有关;肌肉中的PtRXR2表达水平在AB和C期较高,E和D期最低,与肌肉的生长和营养物质积累主要发生在这两个阶段相对应;肝胰腺中的PtRXR2表达水平在AB期最高,C期最低,这暗示PtRXR2主要参与肝胰腺中的上皮细胞增殖和分化,对于C期的营养代谢调控可能不起关键作用。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体重遗传力的估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计了三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力。实验中的400只亲蟹均来自人工养殖的选育群体。通过群体间杂交,构建了37个全同胞家系包括13个半同胞家系,分别测定了80日龄和120日龄时大约30个个体的体重。利用SPSS软件的一般线性模型(GL.M)过程,计算表型变量的方差组分,估计体重性状的遗传力。结果表明,三疣梭子蟹80日龄和120日龄体重的遗传力估计值分别在0.42—0.64和0.25—0.39之间。雌性遗传方差组分均显著大于雄性遗传方差组分,说明雌性遗传方差组分存在显著的母性效应。经过t检验,父系半同胞、母系半同胞方差组分估计的遗传力均未达到显著水平,全同胞方差组分估计的遗传力达到极显著水平。因此可以认为基于全同胞方差组分估计的遗传力是对三疣梭子蟹两个发育阶段狭义遗传力的无偏估计值,估计值分别为0.53和0.35。说明三疣梭子蟹体重属于中度遗传力,对其选择育种具有较大的潜力。     

中国三疣梭子蟹Portunus trituberculatus Miers的研究

本文概述了国内有关三疣梭子蟹形态、习性、繁殖、发育、生长、种群、生理、成分和养殖等方面的研究现状，探讨了关于三疣梭子蟹研究的发展方向。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)FABP基因克隆及其在卵巢发育过程中的表达特征研究

脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)是胞内脂质结合蛋白超家族成员,在长链脂肪酸的摄取、转运及代谢调节中发挥重要作用。本研究采用RACE技术克隆获得三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)脂肪酸结合蛋白基因(简称Pt FABP)c DNA全长,并采用实时荧光定量PCR技术测定了FABP基因在三疣梭子蟹不同组织和不同发育阶段卵巢中的表达情况,探讨了Pt FABP在卵巢发育过程中的作用。Pt FABP基因全长893bp,包括289bp的5’UTR,405bp的ORF和199bp的3’UTR。该基因编码长度为134个氨基酸的多肽,其理论p I为5.92,分子量为15.13k Da。Pt FABP氨基酸序列与中华绒螯蟹同源性最高(72%),且有一个Lipocalin结构域。q PCR的结果表明:FABP在三疣梭子蟹所有组织中均有表达,在卵巢中表达量最高,肝胰腺、眼柄中表达量中等,心脏、鳃、肌肉和血淋巴细胞中的表达较低。在卵巢发育过程中Pt FABP的表达量呈现先上升后下降的趋势,卵巢发育至近成熟期(Ⅳ期)时达到最高值,而在成熟排卵后不断降低。这与三疣梭子蟹卵巢发育伴随着脂类大量积累相关。因此上述研究结果表明,FABP可能参与调控三疣梭子蟹卵巢的发育,并且为后期胚胎的发育储存能量。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因的cDNA克隆及表达分析

通过RT-PCR及Smart?TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP2基因cDNA全长序列。该基因cDNA全长1662bp,编码一个由492个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点为6.348,分子量大小为56.68kD。氨基酸序列中含有CYP基因家族所特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。经氨基酸序列比对及系统进化树分析发现,与岸蟹(Carcinus maenas)的同源性最高,达到75%。实时荧光定量PCR结果表明,CYP2基因在肝胰腺、鳃、肌肉、血淋巴、心脏和眼柄中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。肌肉注射磺胺嘧啶后,三疣梭子蟹高、中、低三剂量组CYP2基因表达较对照组都有上调,并具有时间差异性,低剂量组表达量逐渐降低,趋于对照组,中剂量组和高剂量组表达量先升高后降低,6h后同一时间点,均是高剂量组表达最高,低剂量组最低。表明磺胺嘧啶可诱导三疣梭子蟹CYP2基因,CYP2基因可能参与三疣梭子蟹的药物代谢反应。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)雌雄性腺的差异转录组分析

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)是我国东海海域具有重要经济价值的蟹类。为探讨雌雄梭子蟹性腺基因表达差异,挖掘与性腺发育相关基因,利用高通量测序技术对三疣梭子蟹雌雄性腺进行测序和生物信息学分析,为进一步研究其性腺发育及性别分化机制提供基础。测序结果经denovo组装共获得192848个转录本,130054个unigene。差异表达分析发现,其中101742个unigene上调,37588个unigene下调。在差异表达数据库中筛选出EcR、RXR、VTG等6个可能参与三疣梭子蟹的性腺分化发育的基因,并利用荧光定量PCR验证其在雌雄性腺中的表达情况,验证结果与转录组测序结果基本一致,为深入研究三疣梭子蟹性腺分化发育调控分子机理和相关功能基因提供了重要的基因数据资源。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CYP4C基因的cDNA克隆及表达分析

采用RT-PCR及Smart-TM Race技术,首次获得三疣梭子蟹CYP4C基因cDNA全长序列。该基因全长1888bp,编码一个由514个氨基酸组成的多肽,预测分子量大小为59.54kDa,理论等电点为8.08。氨基酸序列中含有CYP基因家族特有的K螺旋保守序列(ExxR)和血红素结合区(FxxGxxxCxG)。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹CYP4C基因与岸蟹、凡纳滨对虾、日本沼虾、中国对虾、沟虾、红螯螯虾的同源性分别为88%、72%、66%、59%、60%、59%。荧光定量RT-PCR结果表明,CYP4C在肝胰腺、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高。高盐(45)胁迫后,三疣梭子蟹CYP4C的表达量显著高于对照组,随着胁迫时间的延长出现逐渐降低的趋势,在胁迫48h后表达量达到对照组水平;低盐(11)胁迫条件下,CYP4C的表达水平随着胁迫时间的延长呈现逐渐下降的趋势,且从胁迫6h开始显著低于对照组。研究推测,CYP4C基因参与三疣梭子蟹盐度适应调节,是蜕皮机制的调控因子之一。     

氟苯尼考在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)疾病模型内的代谢动力学

为了解健康和疾病条件下药物在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内的代谢差异,在构建三疣梭子蟹溶藻弧菌疾病模型的基础上,按25mg/kg剂量分别给健康和患病三疣梭子蟹单次口灌氟苯尼考后,采用高效液相色谱法测定了其肝胰腺、肌肉和血浆中的药物浓度,药时数据应用3P97药代动力学软件拟合。结果显示:氟苯尼考在健康和患病条件下三疣梭子蟹相同组织中的药时曲线形态相似,三种组织的药时数据均符合带时滞的一级吸收二室开放模型;肝胰腺吸收药物最快,肌肉次之,血浆最慢;与健康组相比,患病蟹肝胰腺、肌肉、血浆三种组织对氟苯尼考的吸收和消除速度明显减慢,达峰时间推迟,半衰期延长,清除率减低,最高药物浓度下降,表观分布容积和药时曲线下总面积变大。说明疾病使氟苯尼考在三疣梭子蟹体内的吸收、分布、代谢和消除均发生了显著变化,建议患病三疣梭子蟹口服氟苯尼考的休药期至少10d。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)foxl2基因功能初探及相关miRNA分析

foxl2在脊椎动物卵巢分化、发育和功能维持等方面具有重要作用,然而其在三疣梭子蟹(Por-tunus trituberculatus)卵巢发育中的功能尚不明确.本研究首先克隆了三疣梭子蟹foxl2(Ptfoxl2)基因cDNA全长序列,该基因5′和3′非编码区域(UTR)长度分别为701?bp和211?bp,开放阅读...     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹饲料中胆固醇的适宜添加量研究

采用单因素实验设计方法, 以初始体重为20g左右的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹为实验对象, 胆固醇添加量为0.003%、0.3339%、0.655%、0.986%、1.303%和1.628%的实验饲料投喂8周, 研究其胆固醇需求量。结果表明, 饲料中添加0.003%—1.628%胆固醇对各处理组的存 活率无显著性影响(P>0.05)。随饲料胆固醇水平的上升, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率呈先上升后下降的趋势, 当饲料胆固醇水平≥0.655%时, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率呈下降趋势。折线模型表明, 饲料中胆固醇添加量为0.6%时, 三疣梭子蟹幼蟹的增重率、性腺指数和壳宽增加达到最高值。根据增重率折线模型结果, 作者认为三疣梭子蟹幼蟹饲料中添加0.6%左右胆固醇较为适宜     

虾蟹混养塘中WSSV对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)致死效应的定量研究

采用实时荧光定量PCR法,在对白斑综合症多发的虾蟹混养塘内三疣梭子蟹体内病毒含量进行定量跟踪检测的基础上,结合电子显微镜及病理切片,对室内经口服、注射两种回感模式处理已感染白斑综合症病毒的濒死三疣梭子蟹体内病毒含量进行实验验证,并观察其体内主要器官组织的病理改变。结果表明,受白斑综合症病毒感染的三疣梭子蟹存活与死亡取决于蟹体内病毒含量,当病毒含量≥109拷贝/ml时均进入濒死或死亡阶段,其主要器官组织均有明显的病理改变。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)低盐耐受性和体重的遗传参数估计及其相关分析

为评估三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体重及其低盐耐受性遗传力,本实验构建了20个三疣梭子蟹全同胞家系,分别在其60、90养殖日龄测量其各个家系的体重,并在60日龄时取每个家系90个个体,在盐度4胁迫下分别在12h、24h、48h、72h统计其死亡率,作为衡量其盐度耐受性指标。利用全同胞方差组分分析法评估其低盐耐受性及体重遗传参数。结果发现三疣梭子蟹在60日龄下,其体重遗传力为0.45,其在12h、24h、48h、72h处理条件低盐耐受性遗传力分别为0.13、0.18、0.21、0.29。通过聚类分析的方法将其耐受性状分为3类,并通过相关性分析发现三疣梭子蟹生长性状与低盐耐受性性状的相关系数为0.143,检验并不显著(P=0.547),说明三疣梭子蟹生长性状与耐低盐性状并不相关,在选育时可采用复合选育,提高育种效率。     

黄海和东海三疣梭子蟹(Portunus triuberbuculatus)的AFLP分析

应用AFLP分子标记技术对我国三疣梭子蟹黄海和东海两群体共40个个体利用10对选择性引物组合进行了遗传多样性分析。共扩增出411个位点,多态位点333个。黄海和东海群体的多态位点比例,Nei基因多样性指数和Shannon遗传多样性信息指数分别为74.5%、63.1%,0.2553、0.2355,0.3827、0.3497,两群体的遗传多样性均处于同一水平。群体间遗传分化系数Gst、Shannon遗传多样性信息指数表明,两群体的遗传变异主要来源于群体内个体间。UPGMA聚类图及两群体的Gst和遗传距离显示两群体间出现了一定的遗传分化。     

不同环境因素对三疣梭子蟹“科甬1号”(Portunus trituberculatus)仔蟹蜕壳的影响

为探究三疣梭子蟹"科甬1号"仔蟹最佳蜕壳环境条件,先采用单因素变量实验设计方法,选取温度、盐度、光照时长、p H和底质五种环境因素,分析其对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响。温度组设置17、20、23和26°C,盐度组设置10、15、25和35,光照时长设置0、12和24h光照组,p H组设置6.0、7.5、8.0、8.5和10.0,底质设置有沙和无沙组。实验结果表明,温度组20°C时仔蟹存活率和蜕壳率最高,但蜕壳所需时间最长,26°C时蜕壳起始最早,所需时间最短,但存活率较低;盐度组中,15和25仔蟹存活率和蜕壳率最高;p H组中,7.5、8.0和8.5仔蟹存活率和蜕壳率最高;有沙组仔蟹存活率显著高于无沙组;而光照时长实验组结果差异不显著(P0.05)。综上所述,得到单因素条件下"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度20—23°C、盐度15—25、正常日周期光照、p H 7.5—8.5,有沙环境中。利用正交设计实验方法,研究温度、盐度、底质3个因素对"科甬1号"仔蟹蜕壳的影响,并构建多元线性回归模型。结果得到"科甬1号"仔蟹最佳环境条件:温度26°C、盐度25,需要有沙环境,并且拟合得到其日存活率线性回归模型以及日蜕壳率线性回归模型。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素PtGAL的基因克隆与原核重组表达

半乳糖凝集素(Galectin)是动物凝集素家族的一员,在脊椎动物和无脊椎动物中都参与了重要的免疫防御反应,是一种重要的免疫因子。通过RT-PCR和RACE技术克隆获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)半乳糖凝集素基因全长,并命名为PtGal。该基因全长875bp,开放阅读框为669bp,编码222个氨基酸,包含一个糖识别结构域CRD(位于16—142位氨基酸),预测蛋白的分子量(Mw)为23529.4Da,理论等电点(p I)为5.21。同源性比对结果显示,PtGal编码的氨基酸序列与中华绒螯蟹、南美白对虾、日本囊对虾galectin的同源性分别为77%、66%、58%。实时荧光定量PCR(qRT-RCR)结果表明,PtGal在三疣梭子蟹肝胰腺、肌肉、肠、胃、鳃、心脏、性腺中都有表达,其中在性腺中的表达量最高,在肝胰腺中的表达量最低,但人工感染溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)后,肝胰腺的表达呈先升高后降低的趋势。利用原核表达系统对三疣梭子蟹PtGal进行了重组表达,并通过纯化复性获得了重组目的蛋白rPtGal,ELISA检测rPtGal与不同细菌及真菌的结合活性,结果表明,该重组蛋白与革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌均有较强的结合。本研究为进一步深入研究三疣梭子蟹半乳糖凝集素的功能奠定了基础。     

CO_2驱动海洋酸化对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)幼蟹甲壳结构和组成成分的影响

大气中过量的CO_2溶解到海水中造成海洋酸化,破坏了海水原有的酸碱平衡和碳酸盐溶解平衡。甲壳类动物甲壳的形成过程依赖于海水正常的酸碱平衡和碳酸钙溶解平衡。本研究以三疣梭子蟹幼蟹为研究对象,采用CO_2与空气的混合气体对自然海水进行曝气,模拟在现有CO_2排放速度下,本世纪末和下世纪末海洋酸化的程度(表层海水p CO_2分别为750μatm,1500μatm),研究不同海洋酸化程度对三疣梭子蟹幼蟹甲壳结构和组成成分的影响。结果发现,海洋酸化导致:(1)三疣梭子蟹幼蟹甲壳上表皮的外表面微刺排列趋于简单化,由2—3个微刺为主要排列形式逐渐变为单个微刺排列的形式;(2)甲壳厚度变薄,甲壳厚度从正常海水对照组(pH 8.13±0.02)90.20±4.85μm,变薄到OA1组(pH 7.98±0.02)84.53±13.71μm,再到OA2组(pH 7.75±0.03)61.94±13.43μm,并且有随海洋酸化程度加重厚度变得更薄的趋势;(3)随着酸化程度的加深,甲壳中甲壳素含量显著上升,从对照组(13.10±0.07)%上升到OA1组(14.22±0.04)%,再到OA2组(14.30±0.06)%(P=0.000**);(4)甲壳中钙、镁元素含量及钙镁比没有明显变化。结果表明海洋酸化对三疣梭子蟹幼蟹甲壳的结构和甲壳素含量产生了较大影响。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)CTL基因SNP位点E4-205 C/T与抗溶藻弧菌相关性分析

C-型凝集素(C-typelectin,CTL)是甲壳类动物体液免疫中重要的免疫因子之一。但CTL基因在溶藻弧菌对三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus)感染的过程中的表达及抗病机制尚有待进一步研究。为初步阐明CTL基因SNP E4-205 C/T位点与抗溶藻弧菌感染相关的分子机制,对不同基因型梭子蟹进行溶藻弧菌感染,通过绝对定量方法分析不同基因型梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中溶藻弧菌的复制情况。发现溶藻弧菌感染后12 h内梭子蟹肝胰腺、肌肉组织中C/C组细菌数量显著高于T/T组,结果表明T/T组梭子蟹抗感染能力显著高于C/C组。进一步对该位点非同义突变(ACT-ATT)导致的一个氨基酸改变(Thr-Ile)的两种蛋白进行体外重组表达,并对两种重组蛋白CTL-ATT及CTL-ACT进行活性分析。发现两种重组蛋白对溶藻弧菌生长均具有一定的抑制作用, CTL-ATT的抑菌活性显著高于CTL-ACT。重组蛋白CTL-ATT与PAMPs的结合活性高于CTL-ACT与PAMPs的结合活性,同时两种蛋白与PAMPs和溶藻弧菌的结合活性具有浓度依赖性。结果表明三疣梭子蟹CTL基因参与机...