马氏珠母贝育珠细胞小片和珠核处理技术研究Ⅰ:不同处理液在海南陵水育珠的效果

研究8组不同小片和核处理液在海南陵水海区的育珠效果,优化、筛选适宜该海区育珠的小片处理液及与之匹配的珠核处理液。结果显示:1)处理组手术贝休养期的吐核率与死亡率均显著低于对照组,表明处理液可促进伤口愈合并抗感染;2)处理组育珠8个月后的珠层厚度平均可达0.5 mm以上,与对照组0.3 mm的珠层厚度差异极显著(P<0.01),表明处理液具有明显促进珍珠质分泌的作用;3)优化筛选出核处理液C3,其增强核亲和力的效果明显优于C1(P<0.05);4)W处理组育珠贝死亡率平均小于22%,明显低于对照组(36.7%)和Y处理组(31.45%)(P<0.01),表明W处理液效果优于Y处理液;5)在8个处理组中,筛选出W0、W2、Y3三个匹配组,其育珠效果明显优于对照组(P<0.01)。引入综合评价指数即优良珍珠数占育珠贝总数的比例,以量化育珠效果便于比较     

马氏珠母贝育珠细胞小片和珠核处理技术研究Ⅱ:不同处理液在广东徐闻的育珠效果

通过海区插核育珠试验,对不同处理液匹配组进行进一步优化、筛选,找出适于广东育珠海区的育贝小片处理液及与之匹配的珠核处理液。结果表明:1)匹配适宜的处理液有降低吐核率的作用,8个试验小组中W0、Y3组的吐核率仅31%~32%,明显低于对照组的46.2%(P<0.01),说明匹配液有明显增加组织亲和力、降低吐核率的效果;2)育珠贝的死亡主要发生在育珠前期,与贝的吐核行为有关;3)小片处理液中,C类药物成分对吐核率的高低有影响,0.6%C2不适宜添加到处理液中,而1%C3添加到处理液中有降低吐核率的效果;4)筛选出W0、W1、Y3三组适宜的匹配方案,即W0、W1、Y3三种小片处理液与核处理液C3匹配适宜,其中W0匹配组育珠效果最佳,即成活率为57.8%,百贝收珠数为101.2粒、优珠率为67.5%,比传统处理组(对照组)有明显提高;5)对W0、W1、Y3三组的不同育珠时限(8、10、13个月)的育珠情况进行了比较,当育珠期延长至1年时,Y3组育珠效果良好;6)利用评价指数(即优质珍珠数占手术贝总数的比例)可评判育珠效果,与分析、综合评估结论一致,前者可量化评判数值,使评判更加直观,简易。     

马氏珠母贝育珠细胞小片和珠核处理技术研究Ⅲ:插核手术贝伤口区弧菌类型的初步研究

从马氏珠母贝(Pinctada martensii)插核部位蘸取组织液分离弧菌,研究插核手术前后室内休养3 d时伤口部位弧菌类型的变化,比较使用不同小片和珠核处理液对手术伤口部位弧菌类型的影响。形态和生理生化特征分型和鉴定结果显示,插核前和休养期贝样上分离的优势弧菌类型无明显差异,只是休养期弧菌的分离频率有所下降;从术后不同处理组的马氏珠母贝伤口上均分离得到7个类型弧菌,弧菌所属的种类也一致,而从未插核的对照组相应部位上只分离到4个类型弧菌,除未分离到副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)外,对照组与两个处理组贝样上分离到的弧菌种类基本上一致。     

马氏珠母贝育珠效果影响因素分析

设立3个实验,分别比较了植核时间、植核贝龄、育珠模式对马氏珠母贝育珠效果影响。实验I,设立A1、A2和A3组,植核时间分别设置4月份、7月份和10月份;实验II,设立B1、B2、B3和B4组,植核贝龄分别设置1.0龄、1.5龄、2.0龄和2.5龄;实验III,设立C1、C2和C3组,育珠模式分别设置海区休养与育珠、池塘休养与育珠和池塘休养与海区育珠。按常规技术植核,经1个月的休养期和15个月的育珠结束后,比较各组间休养与育珠的成活率、留核率、成珠率、优良珠率及育珠绩效值的差异。结果表明:植核时间、植核贝龄、育珠模式对植核贝的成活率和育珠绩效值均存在显著的影响(p值<0.05);对育珠贝的留核率、收珠率和优良珠率无显著性影响(p值>0.05);实验I,A1组(4月份植核)育珠绩效值最高,A2组(7月份植核)育珠绩效值最低;实验II,B2(1.5龄)育珠绩效值最高,B4组(2.5龄)育珠绩效值最低;实验III,C3组(池塘休养与海区育珠)的育珠绩效值最高,C2组(池塘休养与育珠)育珠绩效值最低。马氏珠母贝适宜的植核时间为4月份,适宜的植核贝龄为1.5龄,利用池塘休养结合海区育珠能够有效提高育珠效果。     

马氏珠母贝育珠术前处理和术后休养期软体部生化组成的变化

以2龄马氏珠母贝为材料，建立S1（对照组）、S2（术前处理后不插核）、S3（术前处理后插核）和s4（不做术前处理直接插核）四个试验组，每组500个个体。比较研究了术前处理和休养期间各组软体部干重和糖、脂肪、蛋白质含量的差异。试验结果如下：（1）术前处理后，S2和S3组软体部干重显著小于S1组（P〈0．05）；S2组短期休养后恢复到S1组水平：S3组在休养期结束后仍然显著小于S1组（P〈0．05）。（2）插核后，S4组软体部干重显著小于S1组（p〈0．05）；休养20天后恢复到S1组水平；（3）术前处理后，S2和S3组的软体部糖、脂肪含量明显下降。（4）插核后，S4组的软体部糖、脂肪含量明显下降。（5）试验期间，各组蛋白质含量总体呈上升趋势。结果表明术前处理能够有效降低育珠贝的生理活性：术前处理的马氏珠母贝表现出补偿生长效应，并在营养限制或创伤后的恢复过程中，首先利用体内储存的糖原和脂肪。     

马氏珠母贝育珠术前处理和术后休养期软体部生化组成的变化

以2龄马氏珠母贝为材料,建立S1(对照组)、S2(术前处理后不插核)、S3(术前处理后插核)和S4(不做术前处理直接插核)四个试验组,每组500个个体。比较研究了术前处理和休养期间各组软体部干重和糖、脂肪、蛋白质含量的差异。试验结果如下:(1)术前处理后,S2和S3组软体部干重显著小于S1组(P<0.05);S2组短期休养后恢复到S1组水平;S3组在休养期结束后仍然显著小于S1组(P<0.05)。(2)插核后,S4组软体部干重显著小于S1组(P<0.05);休养20天后恢复到S1组水平;(3)术前处理后,S2和S3组的软体部糖、脂肪含量明显下降。(4)插核后,S4组的软体部糖、脂肪含量明显下降。(5)试验期间,各组蛋白质含量总体呈上升趋势。结果表明术前处理能够有效降低育珠贝的生理活性;术前处理的马氏珠母贝表现出补偿生长效应,并在营养限制或创伤后的恢复过程中,首先利用体内储存的糖原和脂肪。     

马氏珠母贝的术前处理试验

本试验根据马氏珠母贝手术贝的不同生理状态，分别用控制海水流量、饵料等抑制贝的生殖腺发育，或促进生殖腺发育并诱导产卵排精的方法，对手术贝进行术前处理，结果表明：手术后休养期成活率平均为９２．９％，最高的达９５．３％；育珠期成活率平均为７５．３％。最高的一组达８５．３％；平均每个贝留核数１．０６粒，最高的达１．１７粒，同时珍珠质量明显提高。用术前处理方法，产量和产值可提高５２．３％。     

不同温度下马氏珠母贝干露耐受能力及其免疫相关基因表达的变化

【目的】探究马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)对干露胁迫的响应,为马氏珠母贝健康养殖和遗传育种提供基础资料。【方法】在不同温度下对马氏珠母贝进行干露胁迫,探究温度对马氏珠母贝干露耐受的影响;筛选出马氏珠母贝干露胁迫敏感组和耐受组,比较两组的免疫相关基因表达量和植核后休养期存活率。【结果】(1)22~34℃条件下,马氏珠母贝干露耐受能力随温度升高及干露时间延长而降低;(2)22℃下,S组和T组的脯氨酸羟化酶(PHD)、葡萄糖转运蛋白(GLUT)、髓样分化因子(MYD88)、热休克蛋白(Hsp70、Hsp20)和凋亡抑制因子(cIAP)6个基因在干露过程中表达量基本呈上升趋势,组间差异显著(P<0.05);(3)植核试验结果表明耐受组植核后休养期的存活率显著高于敏感组(P<0.05)。【结论】马氏珠母贝在高温环境下干露耐受能力降低,在适温条件下耐受组比敏感组表现出较高的存活率。     

流沙湾海区不同规格马氏珠母贝氨基酸组成的研究

以小(S)、中(M)和大(L)3种规格组马氏珠母贝(Pinctada fucata martensii)为材料,分析不同发育阶段马氏珠母贝的常规营养成分和氨基酸组成变化。结果表明:S组、M组和L组的粗蛋白质量分数分别为59.96%、65.48%和66.80%,粗脂肪质量分数分别为4.06%、4.51%和5.83%,粗灰分质量分数分别为22.24%、18.34%和16.90%,无氮浸出物质量分数分别为13.75%、11.66%和10.48%;S组、M组和L组马氏珠母贝软体部必需氨基酸(EAA)的质量分数分别为17.55%、18.76%和19.44%,必需氨基酸占总氨基酸比率(EAA/TAA)分别为36.57%、36.57%和36.89%;呈味氨基酸(DAA)的质量分数分别为22.50%、24.01%和24.31%,呈味氨基酸占总氨基酸比例(DAA/TAA)分别为46.89%、46.79%和46.26%。随着贝体的生长发育,粗蛋白和粗脂肪的质量分数逐渐升高,粗灰分和无氮浸出物的质量分数逐渐降低;各氨基酸(Gly除外)质量分数呈升高的趋势,且EAA和DAA的质量分数显著升高(P0.05)。     

术后处理对马氏珠母贝育珠贝产珠性能的影响

【目的】为提高马氏珠母贝的育珠效益,比较海水盐度、抗生素和休养方式对马氏珠母贝育珠贝成活率、留核率和优良珠率的影响。【方法】实验1,设置休养海水盐度为22.5、25.1和27.8,以天然海水盐度31.7为对照组;实验2,休养期间,分别使用青霉素和链霉素、盐酸环丙沙星、头孢克肟和硫酸庆大霉素,手术第1天用量为10 mg·L~(-1),植核手术后1 d起使用量为5 mg·L~(-1),连续使用5 d;实验3,分别在室内水池、池塘和天然海区进行马氏珠母贝的术后休养,研究不同术后处理方式对育珠贝产珠性能的影响。【结果与结论】低盐度海水休养对马氏珠母贝育珠贝的优良珠率影响有统计学意义(P 0.05),但对育珠贝成活率和留核率影响无统计学意义(P0.05);休养期间使用抗生素对马氏珠母贝育珠贝的成活率、留核率和优良珠率影响无统计学意义(P0.05);休养方式对育珠贝的成活率和留核率影响有统计学意义(P 0.05),水池休养的育珠贝成活率和留核率最高,海区休养的育珠贝最低。     

马氏珠母贝珍珠囊发育的组织和组织化学研究

按照常规技术进行马氏珠母贝插核育珠,在手术后第1、3、7、15、20、30和60天解剖剪取珍珠囊,利用H E染色等组织化学方法研究马氏珠母贝珍珠囊形成过程中的组织学和组织化学变化。结果表明:珍珠囊表皮细胞来自于移植细胞小片的表皮细胞;在水温27℃条件下,插核后1~3 d来自育珠贝的游走细胞逐渐将细胞小片包围;插核后7~15 d,珠核表面密集来自育珠贝的游走细胞;插核后15～20 d,细胞小片外表皮细胞增殖形成珍珠囊,珍珠囊表皮细胞和细胞核均呈扁平状;插核后20～30 d,扁平状珍珠囊表皮细胞逐渐转变为高柱型,并分泌形成透明的壳皮层物质;在插核后第60天,已形成具有分泌珍珠质功能的扁平状珍珠囊表皮细胞,细胞核呈椭圆形或近圆形。     

马氏珠母贝胚胎和早期幼虫冷冻的研究

0～4℃下,不同发育时期的马氏珠母贝(Pinctada martensii)胚胎和幼虫在不同浓度的DMSO抗冻保护液中放置30min后,置室温恢复,并以不同浓度的DMSO作为抗冻保护液,通过缓慢降温对不同发育时期的胚胎和早期幼虫进行超低温(-196℃)冷冻、35℃水浴快速解冻。结果表明:低温下DMSO对胚胎和早期幼虫活力影响较弱;马氏珠母贝的囊胚和担轮幼虫存活率较低。当DMSO体积分数为14%时,原肠胚的存活率为10%左右,且部分胚胎能够继续发育至D形幼虫;当DMSO体积分数为14%、16%时,解冻后的D形幼虫存活率超过49.9%,其中大部分存活48h以上。     

miR-210在马氏珠母贝外套膜矿化机制中的结构和功能预测

为进一步探究Pm-miR-210在马氏珠母贝贝壳形成的作用,利用miR-RACE技术验证Pm-miR-210的成熟体序列并进行序列分析,通过生物信息学分析来获得Pm-miR-210的前体序列,并进行组织定量和靶位点预测。结果表明,Pm-miR-210的miR-RACE结果与高通量测序结果一致,利用转录组数据库与Pm-miR-210成熟体序列比对,获得的前体序列长度为80 bp并具有典型的颈环结构。多序列比对结果显示,Pm-miR-210成熟体序列的种子区域在不同物种间具有极高的保守性。荧光定量结果得出,Pm-miR-210在外套膜边缘膜和中央膜中均有表达,但表达量差异不具统计学意义(P0.05)。靶向预测分析结果显示,钙调蛋白(calmodulin)、钙调磷酸酶-A亚基(calcineurin A subunit)、N19以及Shematrin-3为Pm-miR-210的候选靶基因。     

我校邓陈茂教授等完成的“珠母贝(黑蝶贝)全人工养殖及育珠的研究”项目通过专家鉴定

2007年5月29日,广东省海洋与渔业局组织由中山大学吕军仪教授为主任的专家委员会,对我校珍珠研究所邓陈茂教授主持、海南省海黎三贝珍珠养殖有限公司、雷州市流沙港荣辉珍珠养殖有限公司协助承担的重点科技项目"珠母贝(黑蝶贝)全人工养殖及育珠的研究"进行了成果鉴定。鉴定委员     

贝类精子质量检测与评价方法的研究Ⅲ:FDA-PI双荧光复染法检测马氏珠母贝精子的存活率

将马氏珠母贝新鲜精液和精子水浴致死精液配制含有不同精子死亡率(0%、20%、40%、60%、80%)的5浓度梯度检测样品,并作为理论精子死亡率,采用二乙酰荧光素(Fluorescein diacetate,FDA)-碘化丙啶(Propidium iodide,PI)双荧光复染法检测精子存活率和质膜完整性。结果表明,FDA和PI能有效区分活精子和死精子,活精子发出绿色荧光,死精子发出红色荧光。各样品实测精子死亡率和理论死亡率之间呈极显著正相关,相关系数r=0.99(p<0.01)。FDA-PI双荧光复染法检测马氏珠母贝精子存活率,灵敏度高,重复性好,准确有效。