印尼热泉中产嗜热碱性蛋白酶菌株筛选及酶学性质研究

采用MSM寡营养培养基从印度尼西亚Pantai cermin,Kalianda和Banyuwedang三个地区的热泉水样、泥样以及沉积物样品中分离获得细菌菌株,通过检测蛋白酶产生透明圈和福林酚蛋白酶活性测定相结合的方法,从中筛选出1株产嗜热蛋白酶的菌株PBI,该菌株经初步鉴定为短杆菌属(Brevibacillus),并对其酶学性质进行了研究。结果表明,菌株PBI产蛋白酶的最适酶活温度为60℃,最适pH值为8.0～9.0,具有较好的热稳定性和pH稳定性,60℃时酶的半衰期为30min,70℃条件下20min仍保持46.1%的酶活,该酶在pH值为5.0～9.0范围的缓冲液中酶活相对稳定。其产嗜热蛋白酶的酶活力最高可达到60.53U/mL,在100℃条件下仍能保留26.37%的相对酶活。Fe2+,Fe3+,Cu2+和Zn2+对嗜热蛋白酶活性具有明显的抑制作用。该嗜热蛋白酶对EDTA敏感,苯甲基磺酰氟(PMSF)、亮抑酶肽(Leupeptin)、苄眯(Benzamidine)和胃蛋白酶抑制剂(Pepstain A)对该嗜热蛋白酶都有一定的抑制作用,说明其酶活性受到丝氨酸、半胱氨酸残基的影响。结果表明,该菌株是1株具有进一步改造利用价值的产蛋白酶菌株。     

海洋芽孢杆菌Bacillus sp. CAMT22370所产葡萄糖氧化酶的分离纯化与表征

前期筛选获得一株海洋源Bacillussp.CAMT22370高产葡萄糖氧化酶菌株,本研究进一步通过离子交换及分子筛层析使Bacillus sp. CAMT22370葡萄糖氧化酶纯化了2.12倍,酶活得率32.37%,比活力达到8.47 U/mg,分子质量约为50 kDa。酶学特性研究表明,此酶在低温下有较好的催化活性,最适温度为30℃,超过30℃时酶活迅速下降, 45℃保温2 h活力降至75%左右;最适pH为6.0,在5.0以下和7.0以上时酶活迅速降低, 9.0时损失35%; Ca~(2+)和Mn~(2+)有明显激活作用, Na~+和Zn~(2+)有轻微激活作用, K~+和Mg~(2+)对酶活无显著影响,而Fe~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)对酶活有明显抑制作用,酶动力学参数Vmax及Km值分别为26.85 (μmol/(L·min))和109.26 (μmol/(L·min)),以上酶学特性与现有酶制剂存在明显不同,研究结果为该葡萄糖氧化酶的开发利用奠定了初步基础。     

河口区芦苇湿地一株耐盐纤维素降解菌的筛选鉴定

筛选高酶活、耐受高盐环境的纤维素降解菌,并对菌株产酶条件进行优化,为木质纤维素类物质的综合利用提供菌源。经刚果红水解圈初筛,纤维素酶活测定复筛,盐度梯度驯化,从辽河河口区芦苇湿地分离出一株高产酶的耐盐纤维素降解菌LHK-T3。经形态观察和16SrDNA序列分析,对菌株进行鉴定,经鉴定属于贪噬菌属(Variovoraxsp.)。探究菌株在高盐环境下的发酵过程中碳源、氮源、温度及pH对其生长量和产酶能力的影响。结果表明,菌株LHK-T3在盐度处于20~35条件下,产酶能力仍保持在最大产酶的50%以上,具有较好的耐盐性;在盐度为25的高盐环境下,最适碳源为麦麸、最适氮源为NH4NO3,在温度为30℃、pH为6.0,发酵时间为72h时,菌株生长速率最高,且具有最大内切葡聚糖酶(CMCase)酶活达到727.62IU/mL。从河口湿地土壤中分离筛选的高效耐盐纤维素降解菌LHK-T3具有较好的耐盐性,在高盐条件下木质纤维素降解等相关领域具有较好的应用前景。     

产低温纤维素酶海洋嗜冷菌的筛选及研究

从黄海的深海海底泥样中筛选出一株产纤维素酶的海洋细菌，初步鉴定为革兰氏阴性杆菌。该菌既能产生羧甲基纤维素酶，又能降解微晶纤维素，互有淀粉酶活。对该菌生长特征及所产纤维素酶的性质进行了初步研究。此菌最适生长温度为20℃，最高生长温度为40℃，在0℃也能生长，是典型的嗜冷菌。该菌所产纤维素酶最适反应温度为35℃，10℃仍有较高酶活，最适pH值为6．0，属酸性酶。     

南极产低温几丁质酶菌株的筛选及分子鉴定

从南极普里兹湾深海底泥样品中分离得到一批嗜冷细菌,对这些嗜冷细菌进行了产几丁质酶菌株的筛选,对其中一株具有较高产酶活性的菌株AC167所分泌的几丁质酶进行了性质分析,并通过16S rDNA序列分析进行了菌株的分子鉴定。该菌株最适生长温度为10℃,最高生长温度为25℃,是典型的嗜冷菌,经16S rDNA序列比较及系统发育分析鉴定为假单胞菌属(Pseudomonas)。该菌株只在低于25℃的条件下分泌几丁质酶,酶的最适反应温度为30°C,属于低温酶。     

对深海适冷菌Pseudomonas sp. SM9915分泌不同适冷蛋白酶的研究

从1855m深的海底泥样中分离到一株产适冷蛋白酶的适冷菌Pseudomonas sp.SM9915，经测定发现该菌株的最适生长温度为20℃，最适产酶温度为15℃，粗蛋白酶的最适酶温度为40℃。在此基础上，采用硫酸铵沉淀和分子筛层析方法对P.sp.SM9915分泌的蛋白酶进行了分离纯化。结果表明，P.sp.SM9915至少分泌三种适冷蛋白酶，并且三种蛋白酶的性质有所不同。这三种蛋白的最适pH分别为8．0、9．0、7．0。最适酶海温度分别为45℃、40℃、40℃；其热稳定性也有明显的差别，40℃下保温，酶活的半衰期分别为11min、5min和27min，表明这三种蛋白酶对低温的适应进化是不同步的。     

产淀粉酶的海洋曲霉菌的分离及酶学特性初步研究

从乐清湾红树林中分离获得2株产淀粉酶的真菌,经初步鉴定为曲霉属菌株,暂命名为曲霉5#和曲霉34#。对它们的生长温度、固体发酵时的产酶条件以及淀粉酶特性进行了初步研究。该研究结果表明,曲霉5#和曲霉34#的最适生长温度分别为30~35℃和25~30℃,最高生长温度分别为40℃和35℃,在10℃下均能生长。对两株菌进行固体发酵时其最佳培养时间为96 h。两株菌所产淀粉酶的最适pH值为7.0,最适反应温度为40℃;淀粉酶在50℃下仍能保持活力,60℃下酶活力开始下降,80℃时酶几乎失活;离子对淀粉酶的激活或抑制作用也相似。     

冷活性纤维素酶性质研究

对海洋嗜冷菌MB1所产冷活性纤维素酶的性质进行了研究。该酶最适反应温度为35℃,0℃时残余酶活约为20％,最适pH值为6．0,在pH5～7．5范围内酶活均较高。该酶对热敏感,50℃保温2h,残余酶活为15％;60℃时,酶完全失活。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

北冰洋海单胞菌β-D-半乳糖苷酶的异源表达及酶学特性研究

初筛表明,一株分离自北极加拿大海盆海冰心芯样品的海单胞菌(Marinomonas sp.BSi20584)具有较高的β-D-半乳糖苷酶活性,为了研究清楚其酶学性质,将经hiTAIL-PCR扩增得到的β-D-半乳糖苷酶基因(galt)与pET-28a(+)原核表达载体结合,转入大肠杆菌BL21(DE3)。经IPTG诱导后对重组β-D-半乳糖苷酶(GALT)的表达条件进行了优化,采用金属螯合亲和层析技术制备纯酶,并对重组GALT的酶学性质进行了研究。结果显示,重组酶的最适诱导温度为20℃,在IPTG浓度为0.07mmol/L时诱导22h后,酶活和产酶量达到最大值。GALT单体分子量约为6.6×104 g/mol,天然酶为同源三聚体。GALT最适作用温度为35℃,其热稳定性较好,在60℃处理5h后,仍可保持50%以上的相对活性。GALT的最适作用pH为9.0,在pH为6.0~11.0范围内比较稳定。GALT的最适NaCl浓度为0.5mol/L,对盐度具有较高的耐受性。Mg2+、K+、DTT和EDTA对酶活不具有显著影响,而Mn2+、Fe2+对酶活有促进作用,Zn2+和L-谷胱甘肽对酶活有抑制作用。GALT对Galβ1-4GlcNAc具有水解作用,而对Galβ1-3GalNAc和Galβ1-3GlcNAc糖苷键型没有水解能力。本研究实现了海单胞菌属菌株的β-D-半乳糖苷酶基因在大肠杆菌系统中的高效表达,并系统研究了重组酶的酶学特性,为后续开展该酶的代谢适应性和潜在应用研究提供详细的酶学数据基础。     

一株海洋几丁质酶产生菌的筛选及其产酶条件的初步研究

从胶州湾的海泥中分离到一株几丁质酶高产菌株。经16SrDNA序列分析,认为该菌属于假交替单胞菌(Pseudoaltermonas),并将其命名为SS01。对该菌产几丁质酶的最佳培养条件进行了研究,发现与其它几丁质酶产生菌相比,SS01菌株的最适产酶温度较低,酶活较高。在Zobell2216E培养基中,SS01菌株培养9h进入稳定期。胶体几丁质可诱导该菌几丁质酶的产生。在几丁质培养基中,SS01菌株产酶的适宜条件是:培养温度24℃,培养基起始pH7.0左右,蛋白胨为N源(5g/L),胶体几丁质为C源(5g/L),170r/min振荡培养130h,酶活可达116.2U/mL。     

印尼热泉菌产热稳定褐藻胶裂解酶的酶学性质研究

以印尼热泉菌为材料,采用以褐藻酸钠为唯一碳源的培养基筛选产褐藻胶裂解酶的菌株,通过16S rDNA序列对产酶菌株进行种属鉴定,并通过硫酸铵沉淀、离子交换层析和凝胶过滤层析从高产酶菌株Aly-B5发酵液上清中纯化获得褐藻胶裂解酶,并对该酶的酶学性质进行了研究。结果表明:高产酶菌株经鉴定为Bacillus属;聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)显示纯化的褐藻胶裂解酶Aly-B5分子量为45kDa,该酶最适作用温度为65°C,75°C时的半衰期为110min,最适pH为7.0;Zn~(2+)、Mg~(2+)、Fe~(2+)对酶活具有明显的抑制作用,但该酶对乙二胺四乙酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)并不敏感;同时,底物特异性实验表明Aly-B5是一种偏好降解聚古罗糖醛酸(poly G)的双功能裂解酶,降解产物主要是二糖。该酶优良的耐热性使其在海藻高值化利用领域具有潜在的应用前景。     

虾头几丁质酶的研究

用中国对虾Ｐｅｎａｅｕｓ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ虾头经处理制得几丁质酶酶液，再经抽提、沉淀和精制几丁质亲和层析，纯化倍数达１０８倍，比活３４４ＩｍＵ·ｍｇ＾－１蛋白质。用聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其纯度，测得分子量为４４７００，等电点为４．５，最适ｐＨ为５，最适温度５５℃。本法简单易行，可应用于大规模生产中。     

栉孔扇贝血淋巴中谷胱甘肽还原酶的活性研究

用酶标仪采用DTNB比色法测定栉孔扇贝(Chlamys farreri)血淋巴中谷胱甘肽还原酶(GR)的活性,并研究pH值、温度、激活剂和抑制剂对血清中该酶活性的影响及酶的热稳定性。结果表明,栉孔扇贝血细胞中GR比活力明显高于血清。血清中GR的最适pH值因缓冲液的不同而稍有差异:用PBS为缓冲液时,最适pH值为7.0;Tris-HCl为缓冲液时,最适pH值为7.5。酶的最适温度为60℃。将血清在20℃,30℃,40℃,50℃,60℃,70℃和80℃温度的水浴中放置30min后于20℃,pH7.5条件下测定该酶的热稳定性,结果显示50℃时酶的比活力最高,低于或高于此温度的酶比活力均下降,80℃时酶活性完全丧失。栉孔扇贝血淋巴中GR属中温型中性酶类,低温下较稳定。EDTA对该酶活性有促进作用,硫酸铜有抑制作用。     

缢蛏超氧化物歧化酶的纯化和性质研究

经加热和硫酸铵分级沉淀，DE-52柱层析和SephadexG-100凝胶过滤，从缢蛏中分离纯化铜锌超氧化物歧化酶（Cu,Zn-SOD)，并对其理化性质进行分析鉴定，结果获得该酶的比活力为3794.9(U/mg)，提纯倍数为607.7.聚丙烯酰胺凝胶电泳蛋白带与活性带相对应，等电点为5.8.该酶是由两个相同的亚基组成的二聚体，相对分子质量为29.6kD。紫外吸收峰在275nm处，KCN和H2O2能抑制酶活性，而Tsuchi-hashi液对酶活性没影响，该酶的最适pH为6-10，最适温度为37℃，热稳定性在63℃以下。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)肝胰腺内源酶性质的初步研究

内源酶是三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)体内重要的酶,往往会导致梭子蟹死后肌肉组织迅速软化,严重影响了蟹肉的贮藏品质。为了探明该酶的基本特性,本试验从三疣梭子蟹肝胰腺中提取了粗酶,优化了提取方法,并对其部分酶学性质进行初步研究。结果表明:三疣梭子蟹肝胰腺内源酶最佳浸提时间段为4～12 h,酶比活显著高于0～4 h和12～14 h;以酪蛋白为水解底物,内源酶作用最适温度为65℃、最适p H范围为7.0～8.0;丝氨酸蛋白酶特异性抑制剂,包括大豆胰蛋白酶抑制剂(SBTI)和苯甲基磺酰氟(PMSF),对内源酶活力的相对抑制率分别为100%、70.46%±6.27%,显著高于其他抑制剂的相对抑制率,推测丝氨酸蛋白酶为主要内源酶;在硫酸铵分级沉淀中,分别以酪蛋白和Boc-Phe-Ser-Arg-MCA为底物,前者最适盐析浓度为0～70%,后者为30%～70%,酶比活显著高于其他盐浓度;当硫酸铵浓度为40%～60%时,盐析蛋白质含量、粗酶酶活和丝氨酸蛋白酶活均显著高于其他盐浓度。     

深海产低温碱性淀粉酶菌Halomonas sp.W7的筛选及发酵条件研究

从27份深海沉积物中筛选到30株产淀粉酶细菌,并对其中的W7菌株的产酶条件及酶学性质进行了研究。对W7菌株进行16SrDNA序列分析表明该菌株属于盐单胞菌属(Halomonas)。其最适生长温度为25℃,能适应pH值7～13和盐度0～100的环境条件。该菌株可利用多种碳源,但只在淀粉存在的条件下产酶,可利用有机氮源和无机氮源,但有机氮源更能促进淀粉酶的产生。产酶的最适条件为:25℃,pH10,接种量2%,盐度50,150r/min摇床培养36～48h。粗酶液的最适作用温度为40℃,最适pH值为10。该菌具有反硝化和氨化活性。     

深海细菌Pseudomonas sp. IOFA1中甲醛歧化酶FM11的纯化及性质研究

从印度洋深海沉积物中分离出一株能够高效降解甲醛的假单胞菌(Pseudomonas sp.IOFA1),该菌株可在40 min内完全降解100 mg/cm~3的甲醛.通过阴离子交换柱层析对菌株破碎液中的粗酶液进行纯化,得到一条具有甲醛降解活性的单一蛋白条带.经MALDI-TOF/TOF质谱鉴定,该蛋白为甲醛歧化酶蛋白(FM11).序列分析表明FM11与其它物种已知醛脱氢酶的氨基酸序列最高相似性为65%;结构域分析表明FM11含有2个保守的锌结合位点和一个NAD结合位点.酶学性质分析结果显示,FM11的最适反应温度为40℃,在25~50℃范围内能够保留95%以上的酶活力,尤其是在高于70℃的高温环境下仍保有约50%的活力,表现出广泛的温度适应性.FM11具有非常广泛的最适反应pH值范围(pH值为5~9),且在pH值4和pH值10时仍分别保留50%和80%左右的酶活力,表现出广泛的pH适应性.在pH值为5~7的条件下孵育1 h后,FM11仍保有97%以上的酶活,且在pH值为7~10条件下孵育1 h后,仍保留90%以上的酶活,表现出极好的酸性和碱性稳定性.Ca~(2+)、Mg~(2+)在低浓度时(0.5 mmol/dm~3)对FM11有较明显的激活作用.这些研究为我们进一步开发Pseudomonas sp.IOFA1甲醛歧化酶在降解甲醛方面的用途奠定了基础.     

一株产低温右旋糖苷酶海洋细菌的筛选和鉴定

从连云港海域筛选得到一株产低温右旋糖苷酶的菌株LP621,经形态特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析和鉴定,该菌株为Pseudoalteromonas tetraodonis.该茵产生低温右旋糖苷酶的最适作用温度为30℃,在80℃保温2.5 h后该酶仍具有40％以上的活性.目前尚无Pseudoalteromo...     

嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用

芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能,并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基,提高凝胶强度,改善琼胶性能.为了发掘能用于琼胶脱硫的新型芳基硫酸酯酶,本研究根据嗜琼胶华美菌(Formosa agariphila)KMM 3901的基因组注释信息,筛选出了一段芳基硫酸酯酶编码序列OUC-FARS6,并在大肠杆菌中对其进行异源表达,研究该酶的酶学性质,初步探究其在琼胶脱硫中的作用.研究表明,该酶的分子量大小为63 kDa,以对硝基苯硫酸酯(pNPS)为底物反应90 min时的最适温度为45℃,最适pH为9.0.Na+和K+对酶活有促进作用,大部分金属离子、SDS和Na2 EDTA都可抑制该酶酶活.动力学结果显示,该酶的Km值为32.63μmol/L,Vmax值为9.25μmol/(L·min).将琼胶与该芳基硫酸酯酶共同孵育后,琼胶内部空隙变小,呈现出较好的空间网状结构.本研究成功发掘了一个新型芳基硫酸酯酶,该酶具有应用于琼胶脱硫的潜力,同时建立了利用该酶进行琼胶脱硫的催化体系.