龙须菜UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因的克隆及其表达与琼胶产量的关系

对红藻龙须菜(Gracilaria leimanei formis)UDP葡萄糖焦磷酸化酶(UGPase)基因的表达与不同藻株中藻体琼胶产量之间的相关性进行研究.通过PCR扩增的方法得到了龙须菜UGPase的基因序列.该基因cDNA序列的全长为2 200 bp,开放阅读框1 485 bp,编码494个氨基酸;龙须菜UGPase基因的氨基酸序列与其它物种的UGPase氨基酸序列相似性较高;该基因是单拷贝的,缺乏内含子;具有特殊的加尾信号.利用荧光实时定量PCR的方法检测UGPase基因相对表达量.结果表明,该基因的表达与琼胶含量存在显著相关性,即在高琼胶组藻株中的表达量显著高于低琼胶组藻株,对琼胶含量高低具有指示作用,显示了在产业化应用中的潜能.     

白色噬琼胶菌QM38β-琼胶酶基因agaD02 的克隆与表达

从白色噬琼胶菌(Agarivorans albus)QM38基因组中扩增到一段编码β-琼胶酶的DNA序列,命名为agaD02。序列相似性分析的结果表明,基因agaD02和弧菌Vibrio sp.JT0107及Vibrio sp.PO-303的琼胶酶基因具有同源性,其相似性程度分别为98.7%和97.4%,而同GenBank中的其他序列同源性很低。对此基因的序列进行了分析,结果表明,其开放阅读框长度为2 868 bp,编码的蛋白质包含955个氨基酸,在蛋白数据库中的编号为ABM90422,推测其分子质量为106 ku,等电点为4.87。利用网上数据库资源和生物学软件对预测的琼胶酶蛋白序列进行了同源性分析和结构分析。设计两端含酶切位点的特定引物,克隆agaD02基因,构建入表达载体pET24a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3),转化后提取质粒进行酶切和电泳验证,转化后的大肠杆菌经诱导可产生胞外琼胶酶。     

海带磷酸甘露糖变位酶(PMM)基因的克隆与表达分析

磷酸甘露糖变位酶(PMM)是褐藻胶和岩藻聚糖合成过程中的关键酶之一。本研究利用c DNA末端快速克隆(RACE)技术,获得2条海带PMM基因(Sjpmm1,Sjpmm2)序列。其中,Sjpmm1的开放阅读框(ORF)长759 bp,其编码的Sj PMM1为卤酸脱卤酶(HAD)超家族成员,含252个氨基酸,分子量约为28.51 k Da;而Sjpmm2的ORF长1866 bp,其编码的Sj PMM2属于磷酸己糖变位酶超家族的成员,含621个氨基酸,分子量约为66.49 k Da。海带PMM的二级结构均以?-螺旋为主。进化分析表明,Sjpmm1来自于原始真核生物,而Sjpmm2来源于质体的第一次内共生作用。实时定量PCR分析发现,海带受到高温或低温胁迫时,Sjpmm1和Sjpmm2转录水平上升,以合成岩藻聚糖抵抗环境影响。此外,利用p MAL-c5X载体对Sj PMM1进行体外表达,得到高浓度的可溶性融合蛋白,为后续的Sj PMM功能分析提供基础。     

嗜琼胶华美菌芳基硫酸酯酶的克隆表达及在琼胶脱硫中的初步应用

芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能,并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基,提高凝胶强度,改善琼胶性能.为了发掘能用于琼胶脱硫的新型芳基硫酸酯酶,本研究根据嗜琼胶华美菌(Formosa agariphila)KMM 3901的基因组注释信息,筛选出了一段芳基硫酸酯酶编码序列OUC-FARS6,并在大肠杆菌中对其进行异源表达,研究该酶的酶学性质,初步探究其在琼胶脱硫中的作用.研究表明,该酶的分子量大小为63 kDa,以对硝基苯硫酸酯(pNPS)为底物反应90 min时的最适温度为45℃,最适pH为9.0.Na+和K+对酶活有促进作用,大部分金属离子、SDS和Na2 EDTA都可抑制该酶酶活.动力学结果显示,该酶的Km值为32.63μmol/L,Vmax值为9.25μmol/(L·min).将琼胶与该芳基硫酸酯酶共同孵育后,琼胶内部空隙变小,呈现出较好的空间网状结构.本研究成功发掘了一个新型芳基硫酸酯酶,该酶具有应用于琼胶脱硫的潜力,同时建立了利用该酶进行琼胶脱硫的催化体系.     

委内瑞拉产地龙须菜藻红蛋白基因的克隆及其系统学研究

本文报道了红藻 Gracilaria lemaneiformis委内瑞拉株的藻红蛋白基因的部分序列 ,将所得序列与其它红藻 - Rhodella violacea,Polysiphonia boldii,Griffithsia monolis,Porphyra tenera,Porphyra yezoensis及青岛产龙须菜的相应序列对齐后 ,进行了系统学研究。结果显示 ,同一属的藻红蛋白 α和 β亚基之间的间隔序列 ,从长度到核苷酸序列均非常相似 ,而同一科不同属或同一目的科间的该序列有很大的不同 ;两不同产地龙须菜的 PE基因在 β亚基上的转换多于颠换 ,说明 β亚基比 α亚基保守 ;委内瑞拉来源龙须菜与青岛产地龙须菜可能不属于同一物种 ,应为同属不同种关系 ;由藻红蛋白基因所得的系统树包括 3个与建立在形态标准上的遗传位置一致的分支 ;藻红蛋白基因序列可用于种间及更高地位的分子系统研究。     

真蛸FAXDC2基因的克隆及其表达分析

FAXDC2(fatty acid hydroxylase domain-containing protein 2)是脂肪酸羟化酶家族中的成员,在脂肪酸的合成与代谢中发挥重要功能。真蛸(Octopus vulgaris)是中国南方近海的经济种类,为了研究饥饿对真蛸FAXDC2(OvFAXDC2)基因表达的影响,本研究从课题组真蛸转录组数据库中筛选获得OvFAXDC2基因序列。采用从头至趾方法进行验证,最终获得OvFAXDC2的cDNA全长序列共1384 bp。它包含100 bp的5′非编码区(UTR)、228 bp的3′UTR和1056 bp的开放阅读框(ORF), ORF共编码351个氨基酸,预测其分子量为3.98 kDa,理论等电点为8.93。系统进化树分析显示,真蛸和加州双斑蛸(O. bimaculoides)聚为一支,而与其他无脊椎动物分开。实时荧光定量PCR分析表明, OvFAXDC2在消化腺中表达量最高,在鳃和鳃心中次之。在幼体饥饿试验中,随着时间的推移, OvFAXDC2表达量先升后降,在第三天达到最高,表明OvFAXDC2表达量的变化趋势可作为幼体代谢是否正常的一个指标。     

厦门沿岸海域杂色鲍中产琼胶酶菌株的筛选及其酶学性质的研究

琼胶酶在食品工业中的多糖降解中有着重要的作用,其经济价值日益凸显,从海洋生物中筛选琼胶酶菌株是获得琼胶酶的一种重要途径.从厦门沿岸海域养殖杂色鲍鱼体内分离得到5株产高效琼胶酶的菌株,其中最高的酶活力达到133.5 U/dm3.经16S rRNA序列分析表明这5株菌株分别属于弧菌属（Vibrio）和假交替单胞菌属（Pseudoa lteromonas）.采用DNS法对这些菌株所产的琼胶酶进行酶学性质研究,结果显示这些酶的最适作用温度均为50℃,最适作用pH值为7.0;Na＋可使A017菌株所产的琼胶酶酶活力提高5倍,Fe2＋对A007、A008、A010、A021菌株所产的琼胶酶酶活力有明显的抑制作用.     

一株产琼胶酶海洋细菌的分离与鉴定

为获得琼胶酶活性高产菌株,对采集的海水样品进行了产酶微生物的分离、筛选和鉴定。经过平板培养预筛和两次摇瓶培养筛选,从浙江省舟山市普陀区近海海水样品中分离到一株琼胶酶产生菌G-5,该菌株液体培养产酶活力可达到413.8 U/mL。G-5菌株的菌落呈乳白色、半透明、表面湿润;菌体革兰氏染色阴性,大小0.58~0.69 μm1.50~2.26 μm;光学显微镜下呈短杆状,略有弧形。G-5菌株的16S rDNA序列与NCBI数据库中15个弧菌属（Vibrio）菌株的16S rDNA有98%的同源性,可以确定G-5菌株是一株弧菌（Vibrio sp.）。     

大黄鱼(Larimichthys crocea)IL-10基因的克隆与表达分析

白细胞介素10(Interleukin 10,IL-10)是一种抗炎细胞因子,可以抑制机体免疫反应。本研究经过分析大黄鱼基因组数据库发现了IL-10同源基因,并对其cDNA编码区序列和基因组DNA序列进行了克隆分析。大黄鱼IL-10(LycIL-10)基因由5个外显子和4个内含子构成,其序列全长1 869bp,其开放阅读框(ORF)长555bp,编码184个氨基酸,其N端的22个氨基酸残基为预测的信号肽,成熟肽由162个氨基酸残基组成,包含了脊椎动物IL-10标志性保守序列。LycIL-10的氨基酸序列同其他已知物种的IL-10氨基酸序列的一致性为26.49%~77.01%。Real-time PCR分析发现LycIL-10在检测的组织中为组成型表达,在脾脏和肌肉中转录水平相对较高。三联灭活细菌疫苗和聚肌苷酸胞苷酸(poly(I∶C))刺激后,大黄鱼头肾和脾脏中LycIL-10mRNA的转录水平会显著升高,表明LycIL-10可能参与抑制大黄鱼由细菌和病毒引起的炎症反应。     

红海榄肉桂酸-4-羟基化酶基因的克隆与表达分析

肉桂酸-4-羟基化酶是木质素合成反应中的关键酶,木质素合成反应对于植物耐受重金属胁迫有重要作用。本研究利用同源克隆和cDNA末端快速扩增方法(rapidamplificationofcDNAends,RACE)从红海榄叶片中克隆得到一条肉桂酸-4-羟基化酶基因,命名为RsC4H,生物信息学分析结果显示RsC4H基因的cDNA全长为2006bp,开放阅读框长1572bp,共编码523个氨基酸。该基因编码蛋白的相对分子质量为60.18kD,是亲水性的不稳定蛋白,二级结构以α螺旋(47.42%)和无规则卷曲(32.70%)为主,该蛋白在N端和C端分别包含一个跨膜结构,不含有信号肽,主要在膜结构或内质网上发挥功能,属于p450超家族。RsC4H蛋白与其他植物的C4H蛋白相似性较高,系统发育树结果显示其与笋瓜(Cucurbita maxima, XP＿023007159.1)、南瓜(Cucurbita moschata, XP＿022947682.1)的亲缘关系更近。qRT-PCR结果显示,红海榄能快速响应重金属胁迫,提高RsC4H基因的表达量,促进木质素生成并增加细胞壁厚度以阻止金属离子进入细...     

藻红蛋白基因部分序列的克隆和顺序分析

报道了真核红藻—龙须菜的藻红蛋白亚基基因的部分序列,位于β亚基的近碳端、α亚基的近氮端,包括β亚基部分３０９个核苷酸,α亚基部分１６２个核苷酸,还有间隔部分５５个核苷酸,可编码β近碳端的１０２个氨基酸和α近氮端的５４个氨基酸,并与目前已知的相应序列做了比较。该序列与已知红藻ＰＥ亚基基因相应部分的相似性为７７．９％到８１．１％。对应的氨基酸序列的相似性为７９．５％到８６．５％,蛋白质序列的保守性高于核苷酸序列。     

大菱鲆mIgD重链基因的克隆与表达分析

利用RACE技术克隆获得大菱鲆(Scophthalmus maximus)膜结合型免疫球蛋白D(Membrane-bounded Ig,mIgD)重链基因的cDNA序列全长,该基因全长3 357bp,包含1个2 997bp的开放阅读框,编码999个氨基酸,基因结构为VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重链恒定区δ1~δ7氨基酸序列同源比对结果显示,其与庸鲽(78%)、鳜(71%)、牙鲆(68%)具有较高的同源性;多序列比对结果显示,大菱鲆mIgD的每个δ恒定区内均存在色氨酸与半胱氨酸保守位点。利用邻位相连法构建硬骨鱼类免疫球蛋白系统发育树,结果显示,鱼类IgD聚为一大支,大菱鲆IgD与庸鲽及牙鲆聚为一支。利用RT-PCR分析了大菱鲆IgD重链基因的组织差异表达,结果显示,其在外周血白细胞、脾脏、前肾及中肾组织中具有较高的表达。将大菱鲆腹腔注射福尔马林灭活鳗弧菌后,实时荧光定量PCR检测其前肾组织中mIgD重链基因应答表达量,结果显示,mIgD重链基因在注射鳗弧菌后呈显著下调趋势,在注射后8h时降至最低值,其相对表达量约为对照组的1/28,然后呈逐渐恢复上调趋势,在48h时mIgD相对表达量与对照组无显著差异。     

龙须菜5.8S rRNA和ITS区的克隆与系统学分析

研究青岛产龙须菜居群内的遗传多样性和系统学分类,通过对龙须菜居群内不同个体的5.8S rRNA-ITS区(包括ITS1-5.8S rRNA-ITS2)进行PCR扩增和序列分析,得到扩增DNA片段长度均为1 066 bp,包含完整的ITS1(250 bp)、5.8S(159 bp)和ITS2(657 bp);利用GenBank数据库对Cracilaria(江蓠属)和Gracilariopsis属共20个物种的rRNA-ITS相应序列进行了比较和系统进化分析.结果表明,龙须莱和江蓠科19个物种中rRNA的5.8S区的长度和序列非常保守,而ITS区的长度和序列则变异较大,20种江蓠科物种的遗传距离在0.013～0.596之间,龙须菜在5.8S rRNA-ITS区特性上相比江蓠属物种与Gracilariopsis属物种更为相似;采用UPGMA法构建了这20种江蓠科物种的系统发育树;分析结果表明青岛产龙须菜的居群内不存在遗传差异,且应属于Gracilariopsis属,并且在江蓠科中较早分化,而龙须菜处于Gracilariopsis属中比较古老的位置.     

龙须菜配子体发育和不同品系四分孢子体四分孢子形成过程显微结构观察

龙须菜配子体和四分孢子体在生殖结构的形成和发育的过程中,出现一系列的细胞形态和结构层面的变化。本实验以龙须菜雌雄配子体和不同品系龙须菜四分孢子体为实验材料,采用连续徒手切片的方法,观察龙须菜配子体发育和不同品系四分孢子体四分孢子形成过程。观察到,雌雄配子体发育经过幼苗期、毛细胞期、性成熟期,幼苗期和毛细胞期雌雄配子体间无明显差异,进入性成熟期后,产生生殖结构时才能将其区分开。四分孢子起源于四分孢子体表皮层细胞,初始为鲜红色直径约5~10 μm的细胞,逐渐生长形成成熟的直径约20~25 μm的四分孢子囊,并分裂为4个四分孢子聚集在四分孢子囊中,在藻体外,四分孢子释放变形成球形,龙须菜四分孢子的形成和发育过程伴随着髓部细胞中红藻淀粉颗粒的减少。其中"981"龙须菜形成较多的畸形四分孢子,可能是其表现低育的一个原因。龙须菜自基部到尖端的表皮层细胞层数、髓部细胞数目和体积均发生连续的变化。细胞连接广泛存在于龙须菜表皮层、皮层和髓部细胞之间,但各层细胞连接大小、数目、长度等都存在差异。释放的四分孢子可能会附着在四分孢子体上,固着器覆盖包绕四分孢子体甚至侵入到破损有伤口的四分孢子体内,形成四分孢子体和配子体在同一株上的世代混杂现象,这也可能是导致龙须菜表现遗传复杂性的原因。     

雄性半滑舌鳎雄激素受体基因的克隆与表达分析

利用RT-PCR方法从半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)中克隆了雄激素受体(Androgen receptor,AR)基因cDNA的部分序列(434 bp),经BLAST比对与狼鲈(Dicentrarchus labrax)、花溪(Kryptolebias marmoratus)、三斑海猪鱼(Halichoeres trimaculatus)和三刺鱼(Gasterosteus aculeatus)的雄激素受体同源性分别为84%,82%,82%和81%.组织表达分析表明,AR基因在半滑舌鳎的性腺、肝、胃、脾、肾、头肾、肠、鳃、心、脑和肌肉这11种组织中均有表达,表达量有所差异.肾中表达量最丰富,鳃中最少.根据其他硬骨鱼类表达模式,推测半滑舌鳎可能只含有1种AR.     

Cloning and Structural Analysis of Calmodulin Gene from the Mangrove Plant Sonneratia Paracaseolaris

Calmodulin is a calcium binding protein that modulates the activity of diverse groups of protein including some protein kinase, adenylate cyclases and ATPase. Here we use the total DNA of Sonneratiaparacaseolaris as the template ofthe polymerase chain reaction (PCR). The PCR primers have been designed and synthesized according to the 5-and 3-terminal oligonucleotide sequences of Calmodulin gene of plants in Genbank and ligated with cloning vector pBsk( ).The recombinant clones have been obtained from the selected medium. The results of DNA sequences analysis show that the nucleotide sequences of ORF share more than 85% homologies as compared with those ofcalmodulin genes of several other plants. Similar to rice and apple, the ORF is interrupted by an intron behind the 75th nucleotide.     

大菱鲆免疫球蛋白轻链IgL全长cDNA的分离、鉴定及表达分析

实验采用末端快速扩增(RACE)技术从大菱鲆脾脏cDNA文库中筛选得到了免疫球蛋白轻链IgL的全长cD-NA片段。该序列包含47 bp的5′末端非编码区(5′UTR),738 bp的开放阅读框(ORF)和202 bp 3′UTR,整个开放阅读框编码246个氨基酸。系统发生分析表明大菱鲆IgL基因与五条鰤的IgL基因起源关系最近。RT-PCR分析表明,大菱鲆IgL基因只在正常脾脏、肾脏和头肾组织中表达;IgL在大菱鲆胚胎发育细胞期就已开始表达,在大菱鲆胚胎尾芽期和体节期表达持续增强;在鳗弧菌感染大菱鲆脾脏和头肾早期均检测到IgL基因强烈表达,后期表达逐渐减弱;大菱鲆胚胎细胞(TEC)在用鳗弧菌感染48h后,IgL开始表达。这些结果均表明IgL基因在大菱鲆免疫应答中起着重要作用。