100株深海真菌次生代谢产物的生物活性初步研究

利用中国＂大洋一号＂第20航次采集的深海沉积物样品进行了真菌分离鉴定,获得110株深海真菌,这些菌分属于15个属.其中曲霉和青霉最多,共为55株,占50%,且重复较多,只分布于10个种.利用CCK8法及琼脂扩散法对其中的100株深海真菌进行了抗肿瘤及抗菌活性检测,发现深海真菌具有良好的生物活性,细胞毒阳性率占49%,26%的菌株具有明显抗大肠杆菌效果、23%明显抗枯草、5%抗白假丝酵母、21%抗金黄色葡萄球菌.生物活性与培养基成分及筛选用肿瘤细胞株类型相关.对具有生物活性的20株深海真菌发酵粗提物进行了HPLC指纹图谱初步分析,发现其HPLC指纹图谱与培养基成分相关.该研究为后期分离鉴定深海真菌产生的生物活性化合物奠定了良好基础.     

海绵微生物的分离培养及一种活性代谢产物的初步研究

研究海绵来源真菌Aspergillus repens发酵产物中的活性代谢产物.分离培养微生物进行活性筛选,采用活性追踪的方法、利用色谱手段分离获得单体化合物,根据波谱分析及其理化性质确定其结构,利用SRB评价单体化合物的抗肿瘤活性,利用纸片法测定单体化合物的抗植物病菌活性.获得1个萘并吡喃酮化合物,其结构鉴定为3,4-二氢-9,10-二羟基-7-甲氧基-3-甲基-1H-萘并[2,3c]吡喃-1-酮 (Semivioxanthin).该化合物对肿瘤细胞A-549、HL-60和BEL-7402有一定抑制作用,对植物致病菌作用较强.海绵微生物代谢产物是发现活性物质重要资源,值得深入研究.     

深海嗜冷希瓦氏菌Shewanella psychrophila WP2的基因组学分析

嗜冷希瓦氏菌Shewanella psychrophila WP2分离自深海沉积物,其拥有目前希瓦氏菌属(Shewanella)中最大的基因组,为6. 4 Mb。通过对S. psychrophila WP2的完整基因组进行系统发育和代谢潜能分析,并与相近菌株进行比较,探究WP2拥有较大基因组的生理和生态意义,深化对Shewanella菌在环境适应性方面的认识。基于串联保守蛋白对WP2基因组进行系统发育分析,根据注释结果对WP2进行代谢通路重建。系统发育进化树显示,WP2属于Group 1分支,和其它嗜冷嗜压Shewanella菌相同,非嗜冷嗜压Shewanella菌株都属于Group 2分支。WP2基因组中与DNA修复、次级代谢产物合成、转运分泌相关的基因数明显多于Shewanella piezotolerans WP3。WP2拥有较多水平转移来源的基因组岛(17个),岛内包含了与嘌呤代谢、氨基糖代谢、运动趋化、群体感应等功能相关的基因。结果表明,通过潜在的水平基因转移,WP2获得了大量的辅助功能基因,增强了它的氮源利用能力、运动和趋化能力,以及应对复杂环境的群体感应能力和抗生素合成功能,从而更加适应生活在寡营养和复杂极端的深海环境。本研究针对S. psychrophila WP2的代谢潜力进行了深入的探索和研究,为将来关于Shewanella菌和微生物的环境适应机制的研究提供了更多数据参考和理论基础。     

一株海绵附生菌Bacillus firmus的培养条件优化及α-GI活性成分初步分析

为寻找新型α-葡萄糖苷酶抑制(α-glucosidase inhibition,α-GI)活性化合物来源,针对前期研究发现的具有α-GI活性的海绵附生微生物坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus),对其发酵培养条件进行优化,并对其活性组分中主要成分进行初步分析.以α-GI活性为主要检测对象,选出蛋白胨、酵母膏、Na Cl和p H值共4个因素进行正交优化试验.结合菌株生长情况和代谢产物产量指标,发现在MB培养基的基础上,蛋白胨质量浓度3 g/dm3、酵母膏质量浓度3 g/dm3、Na Cl质量浓度19.5 g/dm3、p H值为7.5的组合为最优培养条件.在优化后的培养条件下,规模化发酵该菌株,提取其代谢产物粗提物,经活性追踪下的二次色谱柱分离,获得一个高抑制活性组分,抑制率达82.4%.该组分经GC-MS分析后发现,活性组分中主要成分为环二肽类及哌啶酮类物质.本研究结果为寻找新型α-GI活性化合物提供了一个新的、可扩大生产的来源.     

海洋放线菌M313菌株的鉴定及其抗肿瘤活性代谢产物的初步研究

按经典的放线菌分类方法对海洋放线菌M313菌株进行鉴定,用MTT检测法对海洋放线菌M313代谢产物的细胞毒活性与培养基的关系、活性物质的理化性质进行了研究。结果表明,该菌株可初步鉴定为孢杆链霉菌的海洋变种(Streptomycessporovirgulisvar.marinus);该菌株的发酵液对7种肿瘤细胞均具有很强的生长抑制活性,ID50为800～2000;M313菌株在GPDA、高氏一号培养基中均能产生细胞毒性很强的代谢产物;活性物质在pH2～10稳定,但对热不稳定,60℃以上加热处理丧失大部分活性;活性成分可能为分子质量大于2000u的水溶性物质。     

一株海洋放线菌发酵液抗肿瘤活性初探

用四氮唑蓝(MTT)法对96株海洋放线菌、细菌、真菌的发酵液进行细胞毒活性的筛选,结果显示13%的放线菌和3%的细菌发酵液具有细胞毒活性.其中放线菌ACMA006具有显著细胞毒活性,而且能抑制多种肿瘤细胞的生长.进一步用DNAladder电泳分析和荧光染色法观察到放线菌ACMA006发酵液能明显诱导肿瘤细胞凋亡.这株具有抗肿瘤潜力的放线菌ACMA006值得进一步开发研究.     

鱼藤、枫桦和石上柏的细胞毒及抗氧化活性初步研究

对中草药鱼藤、枫桦和石上柏的细胞毒及抗氧化活性进行了初步研究.用人乳腺癌细胞MCF-7、人肺癌细胞A549 和大鼠嗜铬瘤细胞PC12检测了鱼藤、枫桦和石上柏提取物的抗细胞毒作用;并用1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH)检测了提取物的抗氧化活性.结果发现,鱼藤、枫桦和石上柏的甲醇提取物均有细胞毒活性,其中鱼藤甲醇提取物具有很强的细胞毒活性;枫桦甲醇提取物有较强的清除自由基和抗氧化活性.鱼藤植物值得进行抗肿瘤药物应用研究.     

深海沉积物宏基因组文库构建及淀粉酶筛选

深海环境通常具有高盐,高压,高/低温,无光照等特点,使得海洋微生物存在一套独特的生理代谢机制和分子细胞结构,然而迄今绝大部分深海微生物不能在实验室条件下被分离培养,深海微生物资源开发遇到很大挑战。本研究通过不依赖培养的方法研究海洋微生物的基因资源,构建了南海深海沉积物fosmid宏基因组文库,共获得约39 600个克隆,插入片段范围在24~45 kb之间,平均插入片段大小为33 kb,克隆片段的总库容达到1 320 Mb。通过功能筛选获得3个具有淀粉酶活性的克隆子,选取其中最适温度较低的amy7作为进一步研究对象。构建amy7插入片段的重组质粒文库,获得一个同样有淀粉酶活性的克隆子amy7-6。经测序,克隆子amy7-6含有3 291 bp插入片段,序列比对分析后发现其中一个大小为1 920 bp的ORF,其编码的蛋白质序列(AmyS)与各种来源的糖苷酶有着较高的相似性。     

新型葡萄糖-2,5-二酮哌嗪衍生物的设计、合成与细胞毒活性

从海洋天然产物中挖掘高细胞毒活性化合物成为近年来抗肿瘤药物研究工作的一项重要内容。本研究以2,5-二酮哌嗪海洋天然产物Piperafizine B为修饰骨架,在其哌嗪环6位的苄叉邻位引入位阻较大的四乙酰基葡萄糖或葡萄糖基团,共合成了14个2,5-二酮哌嗪衍生物(1a-i,2a-f)。溶解性实验结果初步表明,相较于PiperafizineB,衍生物的脂溶性(1.5～27.9mg·mL^-1,溶剂为二甲亚砜(dimethylsulfoxide,DMSO))与水溶性(0.1～0.9mg·mL^-1,溶剂为磷酸缓冲液,pH7.4)均明显改善。衍生物的细胞毒活性评价结果表明,部分四乙酰基萄糖衍生物的细胞毒活性较好,半抑制率浓度值(IC50)为1.0～9.1μmol·L^-1,并对Huh-7细胞的生长抑制活性具有一定的选择性(3.3～4.5μmol·L^-1)。化合物1c的细胞毒活性最好,对癌细胞株K562、A549及Huh-7的IC50值分别为1.0、3.6与3.3μmol·L^-1。而将乙酰基水...     

黄芪提取物及半合成产物的指纹图谱研究

采用不同的提取方法和合成转化方法,建立了黄芪提取物及半合成产物的高效液相(HPLC)指纹图谱。黄芪提取物的HPLC检测条件为:Apollo-C18(150×4.6 mm,5μm)色谱柱,柱温40℃,流动相为乙腈:水(1:2),检测波长为205nm,流速为1.0 mL/min,进样量为10μl。结果表明:碱提法黄芪甲苷分离效果最好,由低到高的顺序为:水提法<醇提法<超声波法<碱提法;在2%硫酸溶液酸化条件下半合成产物的指纹图谱最好。建立的指纹图谱测定方法,适用于黄芪提取物及半合成产物的质量控制。     

Effect of salinity on the growth, biological activity and secondary metabolites of some marine fungi

The study investigated the effects of salinity on growth,antimicrobial activities and secondary metabolites of 47 marine filamentous fungi isolated from the East China Sea near the western shore of the Taiwan Straits.The results indicate that NaCl promoted the growth up to 91.5% of test strains.However,only 14.9% of them showed a significant increase of antimicrobial activity against Candida albicans.When incubated in different concentrations of NaCl,the colony growth, antimicrobial activities and composition of secondary metabolites of the strain Ty01b-8 of Penicillium sp.varied.Treatment with KCl also showed a similar effect.An alkaloid isolated from the fermentation broth of Ty01b-8 was identified as chrysogine,inhibition activity of which against Hela cells was 15.05% at 20 μ g/ml,and yield was 4.4 and 4.9 times higher in 3 percent and 6 percent NaCl treatments,respectively, compared with the non-salt culture condition. These findings prove that salinity is an important factor influencing growth and secondary metabolites of some marine fungi,which can be used to screen for new metabolites from marine fungi,and to enhance their metabolites production in industrial fermentation.     

多管藻内生真菌Chaetomium globosum.苯甲醛类次生代谢成分研究

从采自青岛近海的红藻多管藻(Polysiphonia urceolata)中分离到一株毛壳霉属真菌球毛壳菌(Chaetomium globosum.),对其发酵代谢产物的化学成分进行了研究。采用溶剂提取、分配,硅胶柱层析、葡聚糖凝胶柱层析以及制备薄层层析等技术已分离获得6个单体化合物,通过一维、二维超导核磁共振技术、质谱技术等鉴定了其中4个化合物的结构,均为苯甲醛类衍生物,分别为2-(1-庚烯基)-3、6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(Ⅰ)、2-庚基-3、6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(Ⅱ)、2-(3、5-庚二烯基)-3、6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(Ⅲ)、2-(1、3、5-庚三烯基)-3、6-二羟基-5-(3-甲基-2-丁烯基)苯甲醛(Ⅳ)。     

耳壳藻内酯分子合成及其抗肿瘤活性的研究

采用四甲基偶氮唑盐(MTT)法体外肿瘤细胞株抑制试验，研究耳壳藻内酯合成过程中结构的衍化物和抗肿瘤活性的关系。结果表明．耳壳藻内酯对小鼠肝细胞癌(H22)、小鼠路易斯肺癌(LLC)、人宫颈癌(Hela)和人乳腺癌(MCF-7)有较强的细胞毒性，对正常小鼠胚成纤维(NIH3T3)和人肝细胞(L—02)的毒性较低。酮基内酯对各肿瘤细胞毒性差异较大，对上述正常细胞株的杀伤力也较大。体外结合DNA的研究表明，耳壳藻内酯芳香环上的羟基较酮基内酯上的酮基易于插入DNA分子中．造成DNA分子的断裂和解聚。标记代谢物前体掺入试验表明，耳壳藻内酯能够显著抑制DNA大分子的合成，阻滞肿瘤细胞的生长。推测耳壳藻内酯芳香环上的羟基是影响其抗肿瘤活性的主要官能团。     

姬松茸提取物组分体外抗病毒感染活性的研究

为了探明姬松茸提取物的体外抗病毒感染活性及其作用方式,进而为水产养殖鱼类高效抗淋巴囊肿病毒(lymphocystis disease virus,LCDV)感染活性物质的开发和鲆蝶类淋巴囊肿病的防治奠定基础,利用热水浸提和酒精沉淀法得到了5种姬松茸提取物组分(E1～5),并利用MTT、细胞病变程度观察等方法研究了5种组分对LCDV感染体外培养大菱鲆鳍细胞(turbot fin cells,TF细胞)的影响作用.细胞毒性实验结果显示,5种组分对体外培养TF细胞均无毒性.细胞病变程度结果表明,本文所得5种姬松茸提取物组分尤其是E5组分具有显著的抗LCDV感染TF细胞的活性.不同方式感染的实验结果进一步显示,5种姬松茸提取物组分抗LCDV感染TF细胞的作用可能主要是通过直接灭活病毒和/或阻断病毒吸附细胞来实现的.     

南海礁栖海藻共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41 403次级代谢产物研究

研究南海礁栖腔节藻Coelarthrum sp.共附生真菌Pestalotiopsis neglecta SCSIO41403的次级代谢产物。采用中压正相柱层析色谱法和半制备高效液相色谱法, 对真菌发酵产物进行分离纯化, 制备获得6个次级代谢产物单体化合物, 使用核磁共振、质谱等波谱学方法, 结合其理化性质以及文献数据对比, 分别鉴定为: gamahorin (1)、microsporaline C (2)、7-hydroxy-5-methoxy-4,6-dimethylphthalidc (3)、demethyl nectriapyrone A (4)、4-hydroxybenzaldehyde (5)和4-hydroxyphenethyl acetate (6)。这6个化合物均为首次从该菌株发现, 其中化合物1、2、5和6是首次从海洋动植物共附生真菌中发现。抗菌活性筛选显示其中化合物3对白色念珠菌有明显抑制活性。     

一种南海鼠尾藻次级代谢产物及其克生活性研究

在卤虫致死活性的指导下,综合运用正、反相硅胶柱层析,Sephadex LH-20凝胶柱层析,制备HPLC等分离技术,对褐藻马尾藻属鼠尾藻Sargassumthunbergii进行了克生活性次级代谢产物研究。从鼠尾藻乙醇提取物的乙酸乙酯相中分离获得11个单体化合物,运用NMR,MS,IR等波谱技术鉴定了结构,分别为:2-[(3S,7S,11S)-3-hydroxy-3,7,11,15-tetramethylhexadecyl]-3,5,6-tri methylcyclohexa-2,5-diene-1,4-dione(1),5-脱氢豆甾醇(2),盐藻甾醇(3),马尾藻甾醇(4),盐藻甾酮(5),过氧化麦角甾醇(6),1-(hexadecy1oxy)-propane-2,3-diol(7),1-(15-methylheptadecy1oxy)-propane-2,3-diol(8),3,7,11,15-tetramethyl-hexadecane-1-ol(9),植醇(10),3-[(1-oxohexadecyl)oxy]-2-[[(9Z,12Z)-1-oxo-9,12-oc-tadecadien-1-yl]oxy]propyl(11)。其中,除化合物10外均为首次从马尾藻属中分离得到。对化合物进行了卤虫致死活性和斑马鱼胚胎毒性评价,结果显示,化合物1,5和6具有中等强度的卤虫致死活性;化合物6具有中等的斑马鱼胚胎毒性,EC50值为21.7μg/mL。     

Algicidal activities of secondary metabolites of marine macroalgal-derived endophytic fungi

Red tide occurrs frequently and causes signi?cant damage to the environment and human health. As a result, development of new effcient and environment friendly red-tide microalgae inhibitors has gained increasing attention in recent times. Algicolous endophytic fungi with unique habitats are promising sources for active agents owing to their abundant secondary metabolites and distinguished activities. In this study, the algicidal activities of 49 marine macroalgal-derived endophytic fungi against phytoplankton Alexandrium tamarense, Prorocentrum donghaiense, Heterosigma akashiwo, and Chattonella marina were examined using 96-well microplate. Four fungal strains, including Aspergillus wentii(pt-1), A. ustus(cf-42),and A. versicolor(dl-29, pt-20), exhibited potent algicidal activities. A total of 32 pure compounds isolated from these fungi were noted to possess dif ferent degrees of algicidal activities. Of those, 11 compounds comprising ?ve anthraquinones, two terpenoids, and four steroids showed high 24-h inhibition rates for the four red tide algae, with 24 h EC₅₀ values ranging from 0.01 to 14.29 μg/mL. Among them, compound1(1,5-dihydroxy-3-methoxy-7-methylanthraquinone) presented the strongest activity against H. akashiwo,and could decrease its chlorophyll a(Chl a) and superoxide dismutase contents and increase the soluble protein, malondialdehyde, and peroxidase contents. These results suggested that the identi?ed anti-algal compound might inhibit the growth of red tide algae by weakening photosynthesis(reducing Chl a content),destroying cell membrane, and damaging the antioxidant system.     

海洋放线菌H2003代谢产物中环二肽成分及其抗肿瘤活性的初步研究

海洋来源放线菌H2003发酵产物的粗提物对小鼠乳腺癌细胞tsFT210具有明显的细胞毒活性。为了发现其抗肿瘤活性成分,采用活性跟踪的分离方法,经多次硅胶柱色谱、凝胶柱色谱及高效液相色谱分离,从菌株H2003发酵液中分离得到了7个环二肽化合物。经核磁共振光谱、质谱和旋光分析,其结构分别鉴定为cyclo(L-Leu-L-Pro)(1),cyclo(D-Val-L-Pro)(2),cyclo(Gly-L-Leu)(3),cyclo(L-Pro-L-Try)(4),cyclo(Gly-D-Phe)(5),cyclo(Gly-L-Pro)(6)和cyclo(L-Ala-L-Phe)(7)。其中化合物1通过SRB法测试表现出弱的抗肿瘤活性,系首次报道。     

Metabolites from mangrove endophytic fungus Dothiorella sp.

Mangroves are special woody plant communities in the intertidal zone of tropical and subtropical coasts. They prove to be a natural microorganisms and new metabolites storage. In the study of mangrove endophytic fungi metabolites, four new compounds, Compounds 1, 2, 3 and 4, as well as a known octaketide, cytosporone B (5), are isolated from an endophytic fungus, Dothiorella sp., HTF3. They all show cytotoxic activities. The elucidation of these structures is mainly based on 1D/2D NMR and ESI-MS spectral analyses.