白斑综合症病毒(WSSV)的宿主调查

用地高辛 (DIG)标记的WSSVDNA探针斑点杂交与原位杂交技术 ,在中国对虾、斑节对虾、南美白对虾、刀额新对虾、脊尾白虾、天津厚蟹、日本大眼蟹体内检测到了WSSV ,它们是WSSV的天然宿主 ;在经人工感染的哈氏美人虾、短脊鼓虾、克氏原螯虾、肉球近方蟹、滕壶体内检测到了WSSV ;在球形侧腕水母、病虾池的桡足类等浮游生物、卤虫无节幼体以及人工浸泡感染卤虫成体体内没有检测到WSSV。经原位杂交检测 ,虾类的甲壳下上皮、胃上皮、附肢、造血组织、鳃等组织器官均可被WSSV侵染 ,其中甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;蟹类的甲壳下上皮和鳃对WSSV敏感 ;在中国对虾、南美白对虾、脊尾白虾、注射感染的克氏原螯虾的精巢中 ,精荚的结缔组织细胞和血细胞呈阳性 ,在中国对虾、脊尾白虾以及注射感染的短脊鼓虾的卵巢中 ,结缔组织细胞和滤泡细胞被WSSV感染。     

对虾白斑综合征病毒分子生物学研究进展

对虾白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus．WSSV)是引起对虾白斑综合症的主要病原。对虾白斑综合症于20世纪90年代初首先在中国台湾地区发生,1994年扩展到整个亚洲的对虾养殖地区。1995年11月,西半球首先发现该病毒,1999年美国中部和南部也有类似的报道。2001年欧洲和澳洲都检测到了WSSV。短短10余年,对虾白斑综合症席卷了全球的对虾养殖地区,给世界对虾养殖业造成了不可估量的损失。     

PCR检测对虾白斑综合征病毒(WSSV)中假阴性的探讨

采用PCR、核酸探针斑点杂交、组织切片等方法研究了PCR检测白斑综合征病毒(WSSV)中的假阴性问题。设计了一对引物用于PCR检测WSSV,PCR扩增的产物长度为235bp,检出极限为0.1pg WSSV DNA。结果表明,PCR检测15例攻毒螯虾鳃样品时出现一例阴性,而经10—106倍稀释后的样品却呈现阳性,推断PCR出现了假阴性。核酸探针斑点杂交及组织切片结果表明注射WSSV的螯虾鳃组织确已被严重感染,进一步证实了PCR假阴性。根据PCR的检出极限及模板稀释梯度,推算出该PCR能成功扩增的引物与模板浓度的比例范围约为2.4×105—2.4×1010。     

白斑综合症病毒(WSSV)的实验室检测技术

主要依据90年代关于对虾病毒病的资料，就病原学检测、血清学检测以及基因组检测技术在WSSV感染检测的应用进行了比较系统的综述。     

两种围栏养殖模式防白斑综合征病毒(WSSV)效果的比较

2003年在乳山养殖场采用两种围栏养殖模式养殖了凡纳滨对虾,并对其防白斑综合征病毒(WSSV)效果进行了比较。结果表明,凡纳滨对虾在养殖过程中WSSV阳性率有下降趋势,浮游动物WSSV阳性率较低,布围隔的防病毒效果好于网围隔。     

高位池养殖对虾携带白斑综合症病毒变化

采用实时荧光定量 PCR 技术研究6口高位池塘斑节对虾和凡纳滨对虾携带WSSV变化,结果表明:养殖过程中凡纳滨对虾WSSV携带量最高为9.7×105拷贝/g;斑节对虾最高携带量为9.5×105拷贝/g.凡纳滨对虾WSSV感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为80.0%;60 d为90.O%;90 d为90.0%;120 d为93.3%,斑节对虾潜伏感染率分别为:苗种没有携带WSSV;30d为73.3%;60d为83.3%;90d为90.O%:120d为96.7%.     

盐度变化对携带白斑综合症病毒(WSSV)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的影响

研究盐度渐变和突变对WSSV在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)体内增殖的影响。结果表明,盐度由起始盐度(23±1)往高盐度(32±1)和低盐度(14±1)突变在整个实验中对凡纳滨对虾的累积死亡率和对虾体内病毒增殖的影响显著(P0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度累积死亡率分别为(61.1±10.7)%、(48.9±1.9)%、(63.3±12.0)%,病毒含量分别为6.0×107、3.7×106、5.3×107 copy/g;后感染WSSV实验,分别为(75.6±3.8)%、(52.2±13.4)%、(63.3±3.3)%;病毒含量分别为5.7×107、2.3×106、2.8×107 copy/g。盐度渐变实验各组至24h对虾死亡率低于18.9%,48h出现死亡高峰,72—96h存在显著差异(P0.05),先感染WSSV实验,高盐度、起始盐度、低盐度最大死亡率分别为(75.6±5.1)%、(38.9±5.1)%、(69.3±6.9)%,病毒含量分别为7.6×107、5.3×106、2.4×106copy/g;后感染WSSV实验分别为(46.7±10)%、(45.6±18.9)%、(74.4±13.9)%;病毒含量分别为5.1×106、4.8×105、1.0×107 copy/g。因此盐度变化会影响对虾的抗病能力,可造成对虾体内WSSV快速增殖;对携带WSSV对虾,盐度变化会大大提高WSSV从潜伏感染转为急性感染的可能,盐度是引起WSSV从潜伏感染转为急性感染的关键影响因子之一。     

二温式多重PCR检测鉴别对虾白斑综合征病毒(WSSV)和传染性皮下及造血器官坏死病毒(IHHNV)的研究与应用

建立了一种同时检测对虾白斑综合征病毒（WSSV）、传染性皮下和造血器官坏死病毒（IHHNV）的二温式多重PCR技术。根据基因库中WSSV（AF369029）和IHHNV（NC002190）基因序列，设计了两对分别与WSSV和IHHNV某段保守基因序列互补的引物，用这两对引物对同一样品中的WSSV和IHHNVDNA模板进行多重PCR扩增，结果均同时得到了两条大小与实验设计相符的593bp（WSSV）和356bp（1HHNV）特异性多重PCR扩增条带，而对其他对虾疾病病原的PCR扩增结果均为阴性；敏感性测定结果表明，该多重PCR技术最低能检测到WSSV和IHHNVDNA各100pg。用该多重PCR对400份临床病料进行检测，结果230份检出WSSV，阳性率57．5％；96份检出IHHNV，阳性率24％；56份同时检出WSSV和IHHNV，阳性率14％。18份为阴性，阴性率为4．5％。结果提示了WSSV和IHHNV广泛存在于中国南方的养殖对虾中，作者建立的二温式多重PCR可以用于这两种病毒的临床快速检测和鉴别诊断。     

白斑综合症病毒(WSSV)感染对虾的途径及滴度研究

本研究利用荧光定量PCR技术,开展了白斑综合征病毒(WSSV)感染途径及染病最低病毒浓度的研究.用病毒分别感染对虾的口腔、鳃、背部甲壳和腹部软壳24 h后,利用qPCR测定血液中的病毒拷贝数,结果显示病毒主要通过口腔和鳃入侵宿主,并通过血液循环进行全身感染,但病毒不能穿过对虾的体表引起感染.此外,将对虾分别放在含不同病毒粒子浓度(101、102、103、104、105个/dm3)或含核衣壳的海水中培养,发现当海水中病毒粒子浓度低于102个/dm3时,对虾没有感染病毒,当浓度达到103个/dm3以上时能引起对虾感染.结果暗示103个/dm3是引起对虾感染的最低病毒粒子浓度,而核衣壳则不具有感染性.     

中国对虾(Penaeus chinensis)的白点综合征病毒(WSSV)的提纯和核酸提取

作者从发生白点综合征的中国对虾中,提取了一株白点综合征病毒,用电镜对纯化的病毒进行了形态学观察,并对病毒纯化过程中蛋白酶抑制剂的使用及离心速度的选择进行了探讨。经蔗糖密度梯度离心,分取各带负染后电镜观察,病毒条带位于４０％～５０％蔗糖梯度之间,其完整毒粒长２２５～２７０ｎｍ,直径７５～８８ｎｍ,有的完整毒粒带有很长的尾,病毒衣壳长２５０～３２０ｎｍ,直径６０～８０ｎｍ。在匀浆使用的缓冲液中加入蛋白酶抑制剂ＰＭＳＦ,可得到完整的带包膜的病毒颗粒,比不使用ＰＭＳＦ的提纯效果要好。经３０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ,５０００ｒ／ｍｉｎ离心２５ｍｉｎ,去除大部分的组织碎片,经１００００ｒ／ｍｉｎ离心１ｈ,可使大部分病毒沉淀。并采用传统的方法对病毒核酸进行了提取,其基因组经初步分析为ｄｓＤＮＡ。     

核酸探针原位杂交检测白斑综合症病毒的组织特异性

从白斑综合症病毒 (whitespotsyndromevirus ,简称WSSV)部分基因组文库中得到核酸探针 ,采用原位杂交检测方法检测对虾甲壳下表皮、胃、后肠、鳃、触角腺的上皮细胞、淋巴器官的基质细胞、肌细胞、心肌细胞及结缔组织细胞 ,原位杂交结果均为阳性。对虾甲壳下表皮的上皮细胞、胃的上皮细胞对病毒较其它部位敏感 ,感染程度高 ;中肠上皮细胞、肝胰腺上皮细胞、淋巴器官内皮细胞未发现感染病毒 ,原位杂交用于WSSV检测 ,比组织切片HE染色更准确、更敏感。在同一组织的同一部位 ,原位杂交所得到的阳性细胞个数比HE多。探针大小不同 ,敏感性也有变化。短的探针 41 3bp敏感性较高 ,长的探针敏感性降低。     

白斑综合症病毒(WSSV)囊膜蛋白VP28基因的克隆及在蓝藻中表达载体的构建

用蔗糖密度梯度离心法分离纯化白斑综合症病毒（WSSV）。设计并合成引物，提取WSSV中国株的基因组DNA作为模板，通过PCR，扩增克隆出VP28基因，利用BamHI和EcoRI切点将VP28基因插入克隆载体pUC19 的多克隆位点上，得到VP28基因的重组克隆质粒，对其进行双向DNA测序。测序结果表明，该基因含有615个核苷酸，与GenBank中已有不同来源的WSSV的序列片段同源性为100％。利用BamHI切点将VP28的基因插入到穿梭表达载体启动子PpsbA的下游，EcoRI酶切鉴定，得到正向连接的可在蓝藻表达的重组穿梭表达载体，命名为pRL-VP28。     

套式PCR检测斑节对虾白斑症病毒(WSSV)

解剖患白斑症斑节对虾的鳃组织 ,制备成不同稀释倍数的模板 ,对其进行白斑症病毒 (WSSV)的 PCR扩增 ,结果显示所建立的套式 PCR的灵敏度大约为一步 PCR的 10 4 倍 ;对感染病毒后不同时期的斑节对虾进行 PCR检测 ,发现感染早期经一步 PCR检测为 WSSV阴性的样品 ,套式 PCR的检测结果为阳性 ;对发病虾塘中的几种甲壳类动物进行 PCR检测 ,发现经一步 PCR检测为阴性的长臂虾、秉氏厚蟹和褶痕相手蟹等宿主 ,套式 PCR的检测结果为阳性。表明所建立的 WSSV套式 PCR检测法较普通的一步 PCR有更大的应用价值和意义     

对虾白斑综合症病毒的诊断和检测

对虾白斑综合症病毒（White Spot Syndrome Virus，WSSV）也叫白斑综合症杆状病毒（WSBV）、系统外胚层和中胚层杆状病毒（SEMBV）、日本对虾杆状核病毒（RV-PJ）、对虾杆状DNA病毒（PRDV）、皮下及造血组织坏死杆状病毒（HHNBV）、中国对虾杆状病毒（PCBV）、淋巴样细胞核性杆状病毒（LNBV）（陈秀男等，1994；Wongteerasupaua等，1995；Inouye 等，1994、1996；黄倢等，1995a；战文斌等，1995；陈细法等，1997），是全球对虾养殖业危害性最大的病毒之一。自1992年WSSV暴发性流行以来，造成了对虾养殖业的严重萎缩。鉴…     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)感染白斑症病毒(WSSV)后大颗粒血细胞的变化

采用抗凡纳滨对虾大颗粒细胞的单克隆抗体，应用免疫细胞化学方法，分析了凡纳滨对虾人工感染白斑症病毒(WSSV)后血细胞中大颗粒细胞的变化。研究表明，凡纳滨对虾感染WSSV后，大颗粒细胞的细胞质较正常细胞的多；从WSSV感染凡纳滨对虾的第1天至第3天，大颗粒细胞的数量增加幅度较大。同时，大颗粒细胞占血细胞总数的比例也增加较大：第1天为15．2％，第2天为18％，第3天增大到45．9％，而后大颗粒细胞的比例稍有下降，到第8天下降到43．3％，但仍明显高于对照组(健康虾的大颗粒细胞比例为15．2％)。